Decreto-Lei n.º 46-A/89 — Actualiza os anexos ao Decreto-Lei n.º 280-A/87, de 17 de Julho, relativo à classificação e rotulagem de substâncias…

• concentração celular em cada um dos frascos para cada um dos pontos de medição e método de medição da concentração celular utilizado,

• valores médios das concentrações celulares,

• curvas de crescimento,

• representação gráfica da relação concentração/efeito,

• valores da CE e método de cálculo,

• CSEO,

• outros efeitos observados.

(1) OCDE, Paris 1981, Test Guideline 201, Decisão c(81) 30 final do Conselho.

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

Apêndice

EXEMPLO DE UM MÉTODO PARA A CULTURA DE ALGAS

Observações gerais

O objectivo do processo de cultura baseado no seguinte método é obter culturas de algas para ensaios de toxicidade.

Devem ser utilizados métodos adequados que garantam que as culturas de algas não sejam contaminadas por bactérias (ISO 4833). Podem ser desejáveis culturas axénicas mas é essencial dispor de culturas de uma única alga.

Todas as operações devem ser efectuadas em condições estéreis a fim de evitar contaminações por bactérias ou outras algas.

Equipamento e materiais

Ver ponto 1.6.1: Preparações e organismos de ensaio.

Métodos para a obtenção de culturas de algas

Preparação de soluções nutritivas (meios)

Todos os sais nutritivos do meio são preparados na forma de soluções concentradas de reserva, que são armazenadas em locais escuros e frescos. Estas soluções são esterilizadas num autoclave ou por filtração.

Prepara-se o meio adicionando a correcta quantidade de solução-mãe de água destilada esterilizada, tendo o cuidado de evitar contaminações. Para um meio sólido, adiciona-se 0,8% de agar.

Cultura de reserva

As culturas de reserva são pequenas culturas de algas que são regularmente transferidas para um meio fresco a fim de servir de material de ensaio inicial. Se as culturas não forem regularmente utilizadas, faz-se a sua cultura em tubos de agar inclinados. São transferidas para um meio fresco pelo menos de dois em dois meses.

As culturas de reserva são cultivadas em frascos Erlenmeyer contendo o meio adequado (com um volume aproximado de 100 ml). Quando as algas são incubadas a 20ºC com iluminação contínua, é necessária uma transferência semanal.

Na transferência, uma determinada quantidade de cultura «antiga», passa-se com pipetas esterilizadas para um frasco com meio fresco, de modo a que a concentração inicial, para as espécies em crescimento rápido, seja cerca de 100 vezes inferior à verificada na cultura antiga.

A taxa de crescimento de uma espécie pode ser determinada a partir da curva de crescimento. Uma vez conhecida, é possível estimar a densidade em que a cultura deve ser transferida para o novo meio, o que deve ser feito antes da cultura alcançar a fase de morte.

Pré-cultura

Pretende-se que a pré-cultura forneça uma adequada quantidade de algas para a inoculação das culturas de ensaio. A pré-cultura é incubada nas condições do ensaio e utilizada quando ainda se encontra em fase exponencial de crescimento, normalmente após um período de incubação de cerca de três dias. Quando as culturas de algas apresentam células deformadas ou anormais, devem ser rejeitadas.

TOXICIDADE EM RELAÇÃO ÀS MINHOCAS

ENSAIO UTILIZANDO SOLO ARTIFICIAL

1 MÉTODO

1.1 Introdução

Neste ensaio laboratorial, a substância de ensaio é adicionada a um solo artificial no qual são colocadas minhocas durante 14 dias. Após este período (e, facultativamente, após 7 dias) examina-se o efeito letal da substância nas minhocas. O ensaio fornece um método para a avaliação, num prazo relativamente curto, do efeito dos produtos químicos nas minhocas, por absorção via cutânea e alimentar.

1.2. Definição e unidade

CL(índice 50): a concentração de uma substância que se considera responsável pela morte de 50% dos animais de ensaio durante o período de ensaio.

1.3. Substância de referência

É utilizada periodicamente uma substância de referência com o objectivo de demonstrar que a sensibilidade do sistema de ensaio não variou significativamente.

Recomenda-se como substância de referência a cloroacetamida de pureza analítica.

1.4. Princípio do método

O solo constitui um meio variável e, por essa razão, é utilizado neste ensaio um solo franco artificial cuidadosamente definido. As minhocas adultas da espécie Eisenia foetida (ver nota em anexo) são mantidas num solo artificial, tratado com diferentes concentrações da substância de ensaio. O conteúdo dos recipientes é espalhado sobre um tabuleiro 14 dias (e facultativamente sete dias) após o início do ensaio e contam-se as minhocas sobreviventes, para cada uma das concentrações.

1.5. Critérios de qualidade

Pretende-se que a ensaio seja o mais reprodutível possível no que diz respeito ao substrato e ao organismo a ensaiar. A mortalidade nos controlos não deve exceder 10% no termo do ensaio, caso contrário este não é válido.

1.6. Descrição do método de ensaio

1.6.1. Materiais

1.6.1.1. Substrato para o ensaio

É utilizado como substrato de base para o ensaio um solo artificial de constituição bem definida. a) Substrato de base (as percentagens são expressas em termos de peso seco):

• 10% de turfa de esfagno (tão próximo quanto possível do pH 5,5-6,0, sem resíduos vegetais visíveis e finamente moído),

• 20% de argila caulinítica, de preferência com mais de 50% de caulinite,

• cerca de 69% de areia industrial com quartzo (predominância de areia fina com mais de 50% de partículas de granulometria 0,05-0,2 mm). Se a substância não for suficientemente dispersível em água é necessário dispor de 10 g por recipiente de ensaio para misturar posteriormente com a substância de ensaio,

• cerca de 1% de carbonato de cálcio (CaCO(índice 3)) pulverizado e quimicamente puro para ajustar o pH a 6,0 (mais ou menos) 0,5;

O substrato para o ensaio contem substrato de base, a substância de ensaio e água desionizada. O teor em água deve corresponder a cerca de 25-42% do peso seco do substrato de base. O teor em água do substrato determina-se por secagem da amostra a 105ºC até se obter um peso constante. O critério-chave é que o solo artificial seja humedecido até à sua saturação. Deve-se proceder à sua mistura cuidadosamente de modo a obter uma distribuição uniforme da substância de ensaio e do substrato. Deve ser referido o modo como é introduzida a substância de ensaio no substrato;

O substrato de controlo contém o substrato de base e água. Se se utilizar um aditivo, um substrato de controlo suplementar deverá conter idêntica quantidade do aditivo.

1.6.1.2. Recipientes de ensaio

Recipientes em vidro, com uma capacidade aproximada de um litro (adequadamente cobertos com tampas de plástico, discos ou filme de plástico perfurados para efeitos de ventilação) cheios com uma dada quantidade de substrato húmido para ensaio ou substrato de controlo, equivalente a 500 g de substrato seco.

1.6.2. Condições do ensaio

Os recipientes devem ser mantidos em câmaras climatizadas a uma temperatura de 20 (mais ou menos) 2ºC com luz contínua. A intensidade da luz deve situar-se entre 400 e 800 luz.

A duração do ensaio é de 14 dias, mas pode-se optar por avaliar a mortalidade após terem decorrido 7 dias desde o início do ensaio.

1.6.3. Método de ensaio

Concentrações de ensaio

As concentrações da substância de ensaio são expressas em peso de substância por unidade de peso seco do substrato de base (mg/kg).

Ensaio de determinação de concentrações

O intervalo de concentrações susceptível de provocar mortalidades de zero a 100% pode ser determinado num ensaio de determinação de concentrações, com o objectivo de fornecer informações relativas ao intervalo de concentrações a utilizar no ensaio definitivo.

A substância deve ser ensaiada nas seguintes concentrações: 1000; 100; 10; 1; 0,1 mg substância/kg de substrato de ensaio (peso seco).

Se se efectuar um ensaio definitivo completo, um meio de ensaio por cada concentração e um meio para o controlo não tratado, cada um dos quais com dez minhocas, pode ser suficiente para o ensaio de determinação de concentrações.

Ensaio definitivo

Os resultados do ensaio de determinação de concentrações são utilizados para escolher pelo menos cinco concentrações segundo uma série geométrica que provoquem uma mortalidade de 0 a 100%, diferindo entre si de um factor constante não superior a 1,8.

Um ensaio que utilize estas séries de concentração deve permitir avaliar com a maior precisão possível o valor de CL(índice 50) e os respectivos limites de confiança.

No ensaio definitivo utilizam-se pelo menos quatro meios de ensaio por concentração e quatro meios de controlo sem tratamento, cada um deles com dez minhocas. Os resultados das repetições destes meios são expressos em termos de média e desvio padrão.

Quando duas concentrações consecutivas, com uma razão de 1,8 entre si, dão apenas mortalidades de 0% e 100%, esses dois valores são suficientes para determinar o intervalo em que se situa a CL(índice 50).

Mistura do substrato de base para o ensaio e da substância de ensaio

Sempre que possível, o substrato para o ensaio deve ser preparado sem quaisquer aditivos além de água. Prepara-se uma emulsão ou dispersão da substância de ensaio em água desionizada ou outro solvente e, imediatamente antes do início do ensaio, mistura-se com o substrato de base para o ensaio, ou pulveriza-se uniformemente sobre ele, com um dispositivo de pulverização para cromatografia em camada fina ou outro semelhante.

Se a substância de ensaio for insolúvel em água, pode ser dissolvida num determinado volume, o mais pequeno possível, de um solvente orgânico adequado (por exemplo: hexano, acetona ou clorofórmio).

Para solubilizar, dispersar ou emulsionar a substância de ensaio apenas se podem utilizar agentes que se volatilizem facilmente. O substrato para o ensaio deve ser arejado antes de ser utilizado. A quantidade de água evaporada deve ser substituída. O controlo deve conter o mesma quantidade de qualquer aditivo.

Se a substância de ensaio não for solúvel, dispersível ou emulsionável, em solventes orgânicos, misturam-se 490 g de substrato de ensaio seco com 10 g de uma mistura de areia fina com quartzo e uma quantidade de substância de ensaio correspondente à dose necessária para tratar 500 g de solo artificial seco.

Para cada meio de ensaio, são colocados, em cada recipiente de vidro, uma dada quantidade de substrato húmido para o ensaio, equivalente a 500 g de peso seco e, sobre a superfície do substrato para o ensaio, 10 minhocas. Estas minhocas foram acondicionadas durante 24 horas num substrato de base húmido semelhante ao de ensaio, após o que foram rapidamente lavadas e a água em excesso absorvida com um papel de filtro antes da utilização.

Os recipientes são cobertos com tampas de plástico, discos ou filmes de plástico perfurados para evitar que o substrato seque e são mantidos nas condições de ensaio durante 14 dias.

A avaliação deve ser efectuada 14 dias (e facultativamente sete dias) após o início do ensaio. O substrato é espalhado sobre uma placa de vidro ou aço inoxidável. Examinam-se então as minhocas e determina-se o número de sobreviventes. Considera-se que as minhocas estão mortas se não reagirem a um ligeiro estímulo mecânico aplicado na extremidade frontal.

Quando o exame é efectuado no 7.º dia, o recipiente enche-se novamente com substrato e as minhocas sobreviventes são de novo colocadas na mesma superfície do substrato de ensaio.

1.6.4. Organismos a utilizar no ensaio

Os organismos a utilizar no ensaio devem ser adultos da espécie Eisenia foetida (ver nota em anexo) (pelo menos com 2 meses de vida e com clitelo), com peso húmido de 300 a 600 mg (ver método de reprodução em anexo).

2.1. Processamento e avaliação de resultados

As concentrações da substância de ensaio apresentam-se em função das percentagens correspondentes de minhocas mortas.

Quando os dados são adequados, o valor CL(índice 50) e os limites de confiança (p = 0,05) devem ser determinados utilizando métodos padrão (Litchfield e Wilcoxon, 1949, ou método equivalente). O valor CL(índice 50) deve ser expresso em mg de substância de ensaio por kg de substrato de ensaio (peso seco).

Nos casos em que o declive da curva de concentrações é demasiado abrupto para permitir o cálculo da CL(índice 50), é suficiente uma estimativa gráfica deste valor.

Quando duas concentrações consecutivas com uma razão de 1,8 entre si provocam 0% e 100% de mortalidade, estes dois valores são suficientes para indicar o intervalo entre o qual se situa a CL(índice 50).

3.1. Relatório do ensaio

O relatório do ensaio deve incluir, se possível, as seguintes informações:

• referir se o ensaio foi efectuado de acordo com os critérios de qualidade acima mencionados,

• tipo de ensaio (ensaio de determinação de concentrações e/ou ensaio definitivo),

• descrição exacta das condições de ensaio ou referir se o ensaio foi efectuado de acordo com o método; devem ser referidos todos os desvios em relação ao método indicado,

• descrição exacta do modo como a substância de ensaio foi misturada com o substrato de base para o ensaio,

• informações relativas aos organismos utilizados no ensaio (espécie, idade, peso médio e intervalo de variação do peso, condições de reprodução e manutenção, fornecedor),

• método utilizado na determinação da CL(índice 50),

• resultados dos ensaios, incluindo todos os dados utilizados,

• descrição dos sintomas ou alterações do comportamento observados nos organismos utilizados no ensaio, mortalidade nos controlos,

• CL(índice 50) ou a mais elevada concentração ensaiada que não provocou mortalidade e a concentração ensaiada mais baixa que provocou uma mortalidade de 100%, catorze dias (e facultativamente sete dias) após o início do ensaio,

• representação gráfica da curva concentração-resposta,

• resultados obtidos com a substância de referência quer em relação ao presente ensaio quer provenientes de anteriores ensaios de controlo de qualidade.

(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decisão C (81) 30 final do Conselho.

(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R. Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, 331 pp.

(3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systematique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 pp.

(4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of evaluating dose effect experiments. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.

(5) Comissão das Comunidades Europeias, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicology of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.

(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land - und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrens-vorschlag «Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden», in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed. Landsberg, 1986.

Apêndice

Reprodução e manutenção das minhocas antes do ensaio

Para reproduzir os animais, colocar 30 a 50 minhocas adultas numa caixa de reprodução com substrato fresco e removê-las ao fim de 14 dias. Estes animais podem ser utilizados para futuros lotes de reprodução. As posturas são utilizadas no ensaio quando atingirem a maturidade (nos termos das condições determinadas, ao fim de 2 a 3 meses).

Condições de reprodução e manutenção

Câmara climatizada: temperatura 20 (mais ou menos) 2ºC, de preferência dispondo de luz contínua (de intensidade 400 a 800 lux).

Caixas de reprodução: recipientes adequados de pequena profundidade, com um volume de 10 a 20 l.

Substrato: Eisenia foetida pode ser criada em vários excrementos animais. Recomenda-se como meio de reprodução a utilização de uma mistura de 50% de turfa e 50% de estrume de cavalo ou vaca. O meio deve ter um pH de aproximadamente 6 a 7 (ajustado com carbonato de cálcio) e baixa condutividade iónica (inferior a 6 mmhos ou 0,5% de concentração de sais).

O substrato deve ser húmido, mas não demasiado molhado.

Além do método acima referido, podem ser utilizados com êxito outros processos.

Nota: Eisenia foetida existe sob a forma de duas subespécies que alguns taxonomistas separaram em espécies (Bouche, 1972). São morfologicamente semelhantes mas uma delas, a Eisenia foetida foetida, apresenta como característica listas ou bandas transversais sobre os segmentos e a outra, a Eisenia foetida andrei, não possui tal característica, apresentando uma coloração avermelhada matizada. Sempre que possível, deve-se utilizar a Eisenia foetida andrei. Podem ser utilizadas outras espécies desde que se disponha da necessária metodologia.

BIODEGRADAÇÃO

ENSAIO DE ZAHN E WELLENS

1.1. Introdução

O objectivo do presente método é a avaliação da biodegradação final potencial de substâncias orgânicas, não voláteis, solúveis em água quando são expostas a concentrações relativamente elevadas de microrganismos num ensaio estático.

Pode-se verificar adsorção físico-química sobre os sólidos em suspensão, o que deve ser tomado em consideração na interpretação dos resultados (ver 3.2).

As substâncias a estudar são utilizadas em concentrações que correspondem a valores de COD que vão de 50 a 400 mg/litro ou a valores de CQO situados entre 100 e 1000 mg/l (COD = carbono orgânico dissolvido; CQO = carência química de oxigénio). Estas concentrações relativamente elevadas asseguram uma boa confiança analítica. Os compostos dotados de propriedades tóxicas podem atrasar ou inibir o processo de degradação.

No presente método, utiliza-se a medição da concentração do carbono orgânico dissolvido ou a carência química de oxigénio para avaliar a biodegradação final da substância de ensaio.

A utilização simultânea de um método analítico específico pode permitir a avaliação da biodegradação primária da substância (desaparecimento da estrutura química inicial).

O método apenas se aplica às substâncias orgânicas que, na concentração utilizada no ensaio:

• são solúveis em água nas condições do ensaio,

• têm uma pressão de vapor negligenciável nas condições do ensaio,

• não exercem efeitos inibidores sobre as bactérias,

• não sofrem uma adsorção importante pelo equipamento de ensaio,

• não desaparecem da solução de ensaio devido à formação de espuma.

Na interpretação dos resultados obtidos, especialmente nos casos em que estes resultados são baixos ou marginais, é útil conhecer as proporções relativas dos principais elementos constituintes da substância de ensaio.

Na interpretação de resultados pouco elevado e na selecção das concentrações de ensaio adequadas, é desejável dispor de informações relativas à toxicidade da substância em relação aos microrganismos.

1.2. Definições e unidades

A taxa de degradação alcançada no final do ensaio constitui a 'Biodegradação no ensaio de Zahn e Wellens':

D(índice T)(%) = [1 - (C(índice T) - C(índice B))/(C(índice A) - C(índice BA))] x 100

em que:

D(índice T) = biodegradação (%) no instante T,

C(índice A) = Valores do COD (ou da CQO) da mistura de ensaio medidos três horas após o início do ensaio (mg/l) (COD = carbono orgânico dissolvido, CQO = carência química do oxigénio),

C(índice T) = valores do COD ou da CQO na mistura do ensaio no momento da colheita da amostra (mg/l),

C(índice B) = valor do COD ou da CQO do ensaio em branco no momento da colheita da amostra,

C(índice BA) = valor do COD ou da CQO do ensaio em branco, medido três horas após o início do ensaio (mg/l).

A taxa de degradação obtida é arredondada até ao valor inteiro da percentagem mais próxima.

A percentagem de degradação é definida como sendo a percentagem de remoção de COD (ou da CQO) da substância de ensaio.

A diferença entre o valor medido após 3 horas e o valor inicial calculado ou de preferência, medido, pode fornecer informações úteis relativas à eliminação da substância (ver 3.2, Interpretação dos resultados).

1.3. Substâncias de referência

No estudo de novas substâncias, podem por vezes ser úteis substâncias de referência; contudo, ainda não podem ser recomendadas substâncias de referência específicas.

1.4. Princípio do método de ensaio

Colocam-se num recipiente de vidro de 1 a 4 litros de capacidade, munido de um agitador e de um arejador, uma solução aquosa de lamas activadas, substâncias nutritivas minerais e a substância de ensaio que constituem a única fonte de carbono. A mistura é agitada e arejada a uma temperatura de 20 a 25ºC, sob uma iluminação difusa ou numa câmara escura durante um período que pode ir até vinte e oito dias. Acompanha-se o processo de degradação determinando o valor do COD (ou da CQO) na solução filtrada, diariamente ou segundo uma outra periodicidade adequada. Após cada período, o COD (ou a CQO) eliminado é referido ao valor verificado três horas após o início do ensaio e expresso em percentagem de biodegradação; isto constitui a medida da taxa de degradação nesse momento. O resultado é representado graficamente em função do tempo, o que permite obter a curva de biodegradação.

Se se utiliza um método analítico específico, podem-se medir as variações da concentração da molécula original atribuíveis à biodegradação (biodegadação primária).

1.5. Critérios de qualidade

A reprodutibilidade do presente método foi provada num ensaio de intercalibração.

A sensibilidade do método é largamente determinada pela variabilidade do ensaio em branco e, em menor extensão, pela precisão da determinação do carbono orgânico dissolvido e da concentração da substância de ensaio no meio.

1.6. Descrição do método de ensaio

1.6.1. Preparações

1.6.1.1. Reagentes

Água utilizada no ensaio: água de beber contendo menos de 5 mg/l de carbono orgânico. A concentração total de iões, cálcio e magnésio não deve ultrapassar 2,7 mmoles/l; se não for o caso, corrigir a diluição com a necessária quantidade de água desionizada ou destilada.

Ácido sulfúrico de pureza analítica (P.A.): 50 g/l.

Solução de hidróxido de sódio P.A.: 40 g/l.

Solução nutritiva mineral: dissolver num litro de água desionizada:

cloreto de amónio, NH(índice 4)Cl, P.A.: 38,50 g,

dihidrogenofosfato de sódio, NaH(índice 2)PO(índice 4).2H(índice 2)O, P.A.: 33,40 g,

dihidrogenofosfato de potássio KH(índice 2)PO(índice 4), P.A.: 8,50 g,

monohidrogenofosfato de dipotássio K(índice 2)HPO(índice 4), P.A.: 21,75 g.

A mistura serve simultaneamente de meio nutritivo e solução tampão.

1.6.1.2. Equipamento

Recipientes de vidro com uma capacidade de 1 a 4 litros (por exemplo, recipientes cilíndricos). Dispositivos de agitação com um agitador em vidro ou em metal fixado a uma haste adequada (o agitador deve descrever um movimento rotativo a cerca de 5 a 10 cm do fundo do recipiente). Pode-se utilizar igualmente um agitador magnético com 7 a 10 cm de comprimento.

Tubo de arejamento em vidro com 2 a 4 mm do diâmetro interno. A abertura do tubo deve situar-se cerca de 1 cm acima do fundo do recipiente.

Centrífuga (cerca de 3550 g).

Potenciómetro.

Aparelho para a medição do oxigénio dissolvido.

Papéis de filtro.

Aparelho de filtração por membrana.

Membranas filtrantes de porosidade 0,45 (mi)m. As membranas filtrantes são adequadas se não libertarem carbono e não absorverem a substância na fase da filtração.

Material de análise para a dosagem do carbono orgânico e a determinação da carência química de oxigénio.

1.6.1.3. Preparação do inóculo

Lavar as lamas activadas provenientes de uma estação de tratamento biológica por sucessivas centrifugações ou decantações com água do ensaio (ver acima).

As lamas activadas devem possuir as características adequadas. Esta lama pode ser obtida numa estação de tratamento de águas residuais em boas condições de funcionamento. Para dispor do maior número possível de diferentes espécies ou de estirpes de bactérias, pode ser preferível misturar os inóculos provenientes de diferentes fontes (por exemplo, de diferentes estações de tratamento, extractos de solo, água de rios, etc.). A mistura deve ser tratada tal como é acima indicado.

Para o controlo da actividade das lamas activadas, ver abaixo «Controlo funcional».

1.6.1.4. Preparação das soluções de ensaio

Num recipiente de ensaio, adicionar 500 ml de água de ensaio, 2,5 ml/l de solução mineral nutritiva e uma quantidade de lamas activadas correspondente a 0,2 a 1,0 g/l de matéria seca na mistura final. Adicionar uma quantidade suficiente de solução de reserva da substância de ensaio de modo a obter, na mistura final, uma concentração de COD de 50 a 400 mg/l. Os valores correspondentes de CQO são 100 a 1000 mg/l. Adicionar água até um volume total de 1 a 4 litros. O volume total escolhido depende do número de amostras a colher para a determinação do COD ou da CQO e do volume necessário para a análise.

Normalmente consideram-se dois litros como o volume satisfatório. Para cada série de ensaios, preparar pelo menos um recipiente controlo (branco) contendo apenas as lamas activadas e a solução mineral nutritiva, diluídas com água de ensaio, até se dispor de um volume total idêntico ao dos recipientes de ensaio.

1.6.2. Execução do ensaio

Agitam-se os recipientes de ensaio com agitadores magnéticos ou agitadores a hélice, sob iluminação difusa ou numa câmara escura, a uma temperatura de 20 a 25ºC. O arejamento processa-se por injecção de ar comprimido purificado por um filtro de algodão em rama e, se necessário, por um frasco de lavagem. Deve-se garantir que a lama não se deposite e que a concentração de oxigénio não desça abaixo de 2 mg/l.

O valor de pH deve ser verificado a intervalos regulares (por exemplo, diariamente) e ajustado a pH 7 a 8, se necessário.

As perdas devidas à evaporação são compensadas, imediatamente antes de cada colheita de amostras, com água desionizada ou destilada nas quantidades adequadas. Um bom método consiste em marcar o nível do líquido no recipiente antes de dar início ao ensaio. Após cada colheita, marcam-se de novo os recipientes (sem arejamento nem agitação). As primeiras amostras são sempre colhidas três horas após o início do ensaio, de modo a permitir detectar uma adsorção da substância de ensaio pelas lamas activadas.

À degradação da substância de ensaio segue-se a dosagem do COD ou da CQO, diariamente, ou a outro intervalo regular. Filtrar as amostras provenientes do recipiente de ensaio e do recipiente de controlo (branco) através de um papel de filtro cuidadosamente lavado. Rejeitar os primeiros 5 ml do filtrado da solução de ensaio. As lamas dificilmente filtráveis podem ser previamente eliminadas por uma centrifugação de 10 minutos. As determinações do COD e da CQO efectuam-se pelo menos em duplicado. A duração dos ensaios prolonga-se até 28 dias.

Observação: As amostras que permanecem turvas são filtradas através de filtros de membrana. Estes não devem libertar nem adsorver matérias orgânicas.

Controlo funcional de lamas activadas

Por cada série de ensaios é necessário prever um recipiente que contenha uma substância conhecida de forma a poder verificar a capacidade funcional de lamas activadas. O dietilenoglicol revelou-se útil para este efeito.

Adaptação

Se as análises são efectuadas a intervalos relativamente curtos (por exemplo diariamente), a curva de degradação pode fazer salientar claramente um fenómeno de adaptação (ver figura 2). O ensaio não deverá, portanto, ser iniciado imediatamente antes de um fim-de-semana.

Se a adaptação tem lugar nos últimos dias do ensaio, este deve ser prolongado até à degradação completa.

Observação: Se for necessário um melhor conhecimento do comportamento da lama, as mesmas lamas activadas são expostas de novo à mesma substância de ensaio de acordo com o seguinte processo:

Parar o agitador e o arejador e deixar precipitar as lamas activadas. Retirar o sobrenadante, encher com água de ensaio até perfazer dois litros, agitar durante 15 minutos e deixar de novo precipitar. Retirar de novo o sobrenadante e utilizar as restantes lamas para repetir o ensaio com a mesma substância, em conformidade com os pontos 1.6.1.4 e 1.6.2 anteriores. As lamas activadas podem igualmente ser separadas por centrifugação em vez de precipitação.

As lamas adaptadas podem ser misturadas com as lamas frescas para atingir 0,2 a 1 g de matéria seca/litro.

Análises

De um modo geral as amostras são filtradas através de um papel de filtro cuidadosamente lavado com água desionizada.

As amostras que permanecem turvas são filtradas através de filtros de membrana (0,45 (mi)m).

Determinar a concentração de COD em duplicado nos filtrados das amostras (rejeitar os primeiros 5 ml) com o auxílio de um aparelho de medição do TOC. Se a análise do filtrado não puder ser efectuada no próprio dia, conservá-la no frigorífico até ao dia seguinte. Não é aconselhável conservá-la mais tempo.

Determinar a concentração da CQO nos filtrados das amostras com o auxílio do dispositivo de análise da CQO, em conformidade com o procedimento descrito no ponto 2 seguinte.

Proceder a, pelo menos, duas determinações da concentração do COD e da CQO nas amostras, em conformidade com as indicações acima fornecidas em 1.6.2. Calcular a percentagem de degradação no instante T de acordo com a fórmula (com as suas definições) dada no ponto 1.2 anteriormente indicado.

Arredondar a taxa de degradação até à unidade de percentagem mais próxima. A taxa de degradação atingida no final do ensaio constitui a «Biodegradação no ensaio de Zahn-Wellens».

Observação: Se se realiza a degradação completa antes do final da duração do ensaio e se este resultado for confirmado por uma segunda análise efectuada no dia seguinte, pode-se dar o ensaio por concluído.

3.1. Relatório do ensaio

O relatório do ensaio, deve incluir, se possível, as seguintes informações:

• a concentração inicial da substância,

• quaisquer outras indicações e os resultados experimentais relativos à substância ensaiada, à substância de referência eventualmente usada e ao ensaio de controlo (branco),

• a concentração após três horas,

• a curva de biodegradação com a respectiva descrição,

• a data e o local de colheita dos organismos de ensaio, fase de adaptação, concentração utilizada, etc,

• as razões científicas de eventuais alterações ao método de ensaio.

3.2. Interpretação dos resultados

A eliminação do COD (ou da CQO) que se produz gradualmente durante um determinado número de dias ou de semanas indica que a substância ensaiada se degrada biologicamente.

Contudo, uma adsorção físico-química pode desempenhar um papel em determinados casos, o que é indicado quando se verifica uma remoção total ou parcial da substância desde o início, durante as primeiras três horas, e a diferença entre os licores sobrenadantes de ensaio e de controlo permanecem a um nível inesperadamente baixo.

São necessários ensaios suplementares se se pretender estabelecer a distinção entre biodegradação (ou biodegradação parcial) e adsorção.

Existem diversos métodos para estabelecer tal distinção, sendo o melhor a utilização do sobrenadante como inóculo num ensaio preliminar (de preferência um ensaio respirométrico).

As substâncias de ensaio que conduzem a uma elevada remoção neste ensaio, não associada à adsorção do COD (ou do CQO), devem ser consideradas como potencialmente biodegradáveis. Uma eliminação parcial, não associada à adsorção, indica que o produto químico é, pelo menos, biodegradável em determinada extensão. Uma eliminação baixa ou nula de COD (ou de CQO) pode ser atribuída à inibição dos microrganismos pela substância ensaiada, o que pode ser também revelado pela lise e perda de lamas, dando origem a sobrenadantes turvos. O ensaio deve ser repetido utilizando uma menor concentração da substância de ensaio.

A utilização de um método analítico específico em relação a um composto ou de uma substância de ensaio marcada com (elevado a 14)C pode permitir uma maior sensibilidade. No caso dos compostos marcados com (elevado a 14)C, a recuperação do (elevado a 14)CO(índice 2) confirmará que se verificou biodegradação.

Quando os resultados se exprimem em termos de biodegradação primária, deve ser dada, se possível, uma explicação relativa à modificação de estrutura química que conduz a uma diminuição da resposta da substância original.

A validade do método analítico deve ser acompanhada da indicação da resposta encontrada no ensaio de controlo (branco).

(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decisão C(81) 30 final do Conselho.

(2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Directiva 84/449/CEE da Comissão, Jornal Oficial das Comunidades Europeias n.º L 251 de 19.9.1984.

Apêndice

EXEMPLO DE UMA AVALIAÇÃO

composto orgânico: ácido 4-etoxibenzóico

Concentração teórica no ensaio: 600 mg/l

COD teórico: 390 mg/l

Inóculo: estação de tratamento de águas residuais de ...

Concentração: 1 grama matéria seca/litro

Estado de adaptação: não adaptado

Análise: determinação do COD

Volume da amostra: 3 ml

Substância de controlo: dietilenoglicol

Toxicidade do composto: sem efeitos tóxicos para valores inferiores a 1000 mg/l

Ensaio realizado: ensaio em tubos de fermentação

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

BIODEGRADAÇÃO

ENSAIOS DE SIMULAÇÃO DE LAMAS ACTIVADAS

1.1. Introdução

1.1.1. Observações gerais

Este método aplica-se apenas às substâncias orgânicas que nas concentrações utilizadas no teste:

• são suficientemente solúveis em água para permitir a preparação das soluções de ensaio,

• têm uma pressão de vapor negligenciávei nas condições do ensaio,

• não provocam um efeito inibidor sobre as bactérias.

Na interpretação dos resultados obtidos, especialmente nos casos em que os resultados são pouco elevados ou marginais, serão úteis as informações respeitantes às proporções relativas dos principais componentes da substância de ensaio.

Para a interpretação dos resultados pouco elevados e na selecção das adequadas concentrações de ensaio, são desejáveis informações relativas à toxicidade da substância para os microrganismos.

1.1.2. Determinação da biodegradação final (análises COD/CQO)

O objectivo do presente método é determinar a biodegradação final medindo a remoção da substância e quaisquer metabolitos num modelo de uma estação de lamas activadas a uma concentração correspondente a mais de 12 mg COD/l (ou aproximadamente 40 mg de CQO/l). Parece ser 20 mg COD/l o valor óptimo. (COD = carbono orgânico dissolvido; CQO = carência química de oxigénio).

Deve ser determinado o teor em carbono orgânico (ou a carência química de oxigénio) de uma substância a ensaiar.

1.1.3. Determinação da biodegradação primária (análise específica)

O objectivo do método é determinar o biodegradação primária de uma substância num modelo de uma estação de lamas activadas, a uma concentração de cerca de 20 mg/l, utilizando um método analítico específico (podem utilizar-se concentrações maiores ou menores se o método analítico e as características de toxicidade o permitirem), o que torna possível a avaliação da biodegradação primária de uma substância (desaparecimento da estrutura química inicial).

O objectivo do presente método não é a determinação da mineralização da substância de ensaio.

Deve ser possível dispor de um método analítico adequado para a determinação da substância de ensaio.

1.2. Definições e unidades

1.2.1. Análise COD/CQO

A taxa de remoção de uma substância é dada pela fórmula:

TR = (T - (E - E(índice O)))/T x 100% [1(a)]

em que:

TR = taxa de remoção em percentagem de COD (ou de CQO) ao longo de um dado tempo de retenção médio da substância de ensaio,

T = concentração da substância de ensaio no afluente, em mg de COD/l (ou mg de CQO/l),

E = concentração de COD (ou CQO) no efluente da unidade de ensaio, em mg de COD/l (ou em mg de CQO/l),

E(índice O) = concentração de COD (ou CQO) no efluente da unidade em branco, em mg COD/l (ou CQO/l).

A degradação é expressa em termos de percentagem de remoção de COD (ou de CQO) no decurso de um dado tempo de retenção da substância de ensaio.

1.2.2. Análise específica

A percentagem de eliminação da substância de ensaio da fase aquosa (R(índice W)) durante um dado tempo de retenção médio é dada pela fórmula:

R(índice W) = (C(índice I) - C(índice O))/C(índice I) x 100% [1(b)]

em que:

C(índice I) = concentração da substância no afluente da unidade de ensaio (mg de substância/l, determinada por análise específica),

C(índice O) = concentração da substância no efluente da unidade de ensaio (mg de substância/l, determinada por análise específica).

1.3. Substâncias de referência

Quando se estuda uma nova substância, podem, por vezes, revelar-se úteis substâncias de referência; contudo, ainda não podem ser recomendadas substâncias de referência especiais.

1.4. Princípios dos métodos de ensaio

Para a determinação da biodegradação final utilizam-se em paralelo duas unidades-piloto de lamas activadas (ensaio de confirmação OCDE ou unidades de vasos porosos). A substância de ensaio é adicionada ao afluente (águas residuais sintéticas ou domésticas) de uma das unidades, enquanto a outra recebe apenas as águas residuais. Para a determinação da biodegradação primária, com uma análise específica do afluente e do efluente, apenas se utiliza uma unidade.

As concentrações de COD (ou de CQO) são medidas nos efluentes, ou recorre-se a análises específicas para determinação das concentrações da substância.

O COD atribuível à substância de ensaio não é determinado, mas simplesmente referido.

Quando se efectuam medições do COD (ou de CQO), considera-se que a diferença entre as concentrações médias do efluente do ensaio e do efluente do controlo é devida à substância de ensaio não degradada.

Quando se efectuam análises específicas, podem ser medidas variações de concentração da molécula mãe (biodegradação primária).

As unidades podem funcionar segundo o «método das unidades interligadas», através de um processo de transinoculação.

1.5. Critérios de qualidade

A concentração inicial da substância depende do tipo de análise efectuada e respectivas limitações.

1.6. Descrição do método de ensaio

1.6.1. Preparação

1.6.1.1. Equipamento

É necessário um par de unidades do mesmo tipo, excepto quando são efectuadas análises específicas. Podem ser utilizados dois tipos de equipamento:

Ensaio de confirmação da OCDE

O equipamento (Apêndice 1) consiste num recipiente de armazenagem (A) para as águas residuais sintéticas, uma bomba de doseamento (B), um recipiente de arejamento (C), um decantador (D), uma bomba de ar comprimido (E) para reciclar as lamas activadas e um recipiente (F) para a recolha do efluente tratado.

Os recipientes (A) e (F) devem ser de vidro ou de uma matéria plástica adequada e com uma capacidade de pelo menos 24 litros. A bomba (B) deve fornecer ao recipiente de arejamento um fluxo constante de águas residuais sintéticas; pode ser utilizado qualquer sistema adequado, desde que se assegure o fluxo de entrada e a concentração.

Durante o funcionamento normal, a altura do decantador (D) é fixada de modo a que o volume contido no recipiente de arejamento seja de 3 litros de licor misto. É suspenso no recipiente (C), por cima do cone, um arejador poroso (G). A quantidade de ar insuflada através do arejador deve ser registada por meio de um medidor de fluxo.

A bomba de ar comprimido (E) é fixada de modo a que as lamas activadas provenientes do decantador sejam contínua e regularmente recicladas para o recipiente de arejamento (C).

«Vaso poroso»

O vaso poroso é constituído por folhas de polietileno poroso (2 mm de espesura, diâmetro máximo dos poros 95 (mi)m), enroladas de forma a constituir um cilindro de 14 cm de diâmetro, com uma base cónica de 45º (Figuras 1 e 2 do Apêndice 2). O vaso poroso é colocado dentro de um recipiente estanque em matéria plástica adequada com 15 cm de diâmetro e com um orifício na parte cilíndrica a 17,2 cm da base do cilindro que determina a capacidade (3 l) do vaso. À volta do topo do vaso interior existe um anel de suporte rígido, em matéria plástica adequada de modo a que exista um espaço para o efluente de 0,5 cm entre os recipientes interior e exterior.

Os vasos porosos podem ser colocados na base de um banho de água controlado termostaticamente. Na base do vaso interior são colocados difusores adequados de modo a haver um fornecimento de ar na base.

Os recipientes (A) e (E) devem ser de vidro ou de matéria plástica adequada com uma capacidade de, pelo menos, 24 litros. A bomba (B) deve fornecer ao recipiente de arejamento um fluxo constante de águas residuais sintéticas; pode ser utilizado qualquer sistema adequado, desde que sejam assegurados o fluxo de entrada e a concentração.

São necessários vasos porosos interiores de reserva para substituir qualquer um que eventualmente seja obstruído durante a utilização; os vasos obstruídos podem ser limpos por imersão durante 24 horas numa solução de hipoclorito, seguida de uma lavagem cuidadosa com água da torneira.

1.6.1.2. Filtração

Aparelho de filtração de membrana e filtros de membrana, com uma porosidade de 0,45 (mi)m. Os filtros de membrana são adequados se se garantir que não libertam carbono nem absorvem a substância de ensaio na fase de filtração.

1.6.1.3. Águas residuais

Pode ser utilizado quer um efluente sintético adequado quer águas residuais domésticas.

Exemplo de um efluente sintético

Dissolver por cada litro de água da torneira:

Peptona: 160 mg,

Extracto de carne: 110 mg,

Ureia: 30 mg,

NaCl. 7 mg,

CaCl(índice 2).2H(índice 2)O: 4 mg,

MgSO(índice 4).7H(índice 2)O: 2 mg,

K(índice 2)HPO(índice 4): 28 mg.

Águas residuais domésticas

Devem ser diariamente colhidas do sobrenadante do tanque de decantação primária de uma estação de tratamento que trate predominantemente águas residuais domésticas.

1.6.1.4. Solução de reserva da substância de ensaio

Deve ser preparada uma solução da substância de ensaio, por exemplo a 1%, para se adicionar a concentração da substância de modo a que se conheça o volume adequado a adicionar à água residual ou directamente à unidade, através de uma segunda bomba que forneça a concentração de ensaio necessária.

1.6.1.5. Inóculo

Observação: Quando se utilizam águas residuais domésticas, não se justifica a utilização de um inóculo com uma baixa concentração de bactérias, mas podem-se utilizar lamas activadas.

Pode-se utilizar uma grande variedade de inóculos.

Apresentam-se três exemplos de inóculos adequados.

O inóculo deve ser recolhido de um efluente secundário de boa qualidade, proveniente de uma estação de tratamento que trate predominantemente águas residuais domésticas. O efluente deve ser mantido em condições aeróbias no período entre a colheita das amostras e a sua utilização. Para preparar o inóculo filtra-se a amostra através de um filtro grosseiro e rejeitam-se os primeiros 200 ml. Mantém-se o filtrado em condições aeróbias até ser utilizado. Deve-se utilizar o inóculo no próprio dia da sua colheita e na inoculação devem-se utilizar pelo menos 3 ml.

Inóculo de efluente secundário:

Ver a descrição anterior.

Inóculo do solo:

Faz-se a suspensão de 100 g de terra de jardim (fértil, não esterilizada) em 1000 ml de água de beber isenta de cloro. (Não são adequados solos com uma fracção extremamente elevada de argila, areia ou húmus). Após agitar a suspensão, deixa-se sedimentar durante 30 minutos. Filtra-se o sobrenadante através de um papel de filtro grosseiro, rejeitando-se os primeiros 200 ml. Areja-se imediatamente o filtrado e mantém-se arejado até ao momento da sua utilização. Deve-se utilizar o inóculo no próprio dia da sua colheita.

Inóculo de uma água superficial:

Obtém-se um outro inóculo parcial a partir de uma água superficial mesossapróbica. Filtra-se a amostra através de um papel de filtro grosseiro, rejeitando os primeiros 200 ml. Mantém-s o filtrado em condições aeróbias até ao momento da sua utilização. Deve-se utilizar o inóculo no próprio dia da sua colheita.

Juntam-se volumes iguais das três amostras de inóculos parciais, misturam-se cuidadosamente e retira-se o inóculo final desta mistura. Deve-se utilizar na inoculação pelo menos 3 ml.

Pode ser utilizado como inóculo um determinado volume (não superior a 3 litros) de lamas activadas (teor em sólidos suspensos até a 2,5 g/l) colhidos de um tanque de arejamento de uma estação que trate predominantemente águas residuais domésticas.

1.6.2. Método

O ensaio é efectuado à temperatura ambiente, que deve ser mantida entre 18ºC e 25ºC.

Se tal for conveniente, o ensaio pode ser efectuado a uma temperatura inferior (até 10ºC); se a substância se degradar, não será normalmente exigida qualquer outra operação. Se, contudo, a substância não for degradada, o ensaio deve ser prosseguido a uma temperatura constante entre 18ºC e 25ºC.

1.6.2.1. Período inicial: formação das lamas/estabilização das unidades

O período de crescimento/estabilização das lamas é o período durante o qual a concentração de sólidos suspensos nas lamas activadas e a eficiência das unidades evolui até uma fase estacionária nas condições de funcionamento utilizadas.

O período inicial é o período que se estende desde o momento em que a substância de ensaio é adicionada pela primeira vez até ao instante em que a sua remoção atinge uma fase estacionária (valor relativamente constante). Este período não deve ultrapassar seis semanas.

O período de avaliação é de três semanas, a contar do momento em que a remoção da substância de ensaio atinge um valor relativamente constante e, em geral, elevado. Para as substâncias que apresentam uma degradação baixa ou nula durante as primeiras seis semanas, o período de avaliação considera-se como sendo as três semanas seguintes.

Começar por encher a(s) unidade(s) necessária(s) a um ensaio com o inóculo misturado com o afluente.

Accionam-se então o arejador [e a bomba de ar comprimido (E) no caso do ensaio de confirmação da OCDE] e a bomba de doseamento (B).

O afluente, sem a substância a ensaiar, deve passar através do recipiente de arejamento (C) quer à velocidade de um litro por hora quer à velocidade de meio litro por hora, o que dá um tempo de retenção médio de três ou seis horas.

A taxa de arejamento deve ser regulada de modo a que o conteúdo do recipiente (C) se mantenha constantemente em suspensão enquanto o teor em oxigénio dissolvido seja pelo menos de 2 mg/l.

Deve-se evitar a formação de espuma mediante meios adequados. Não devem ser utilizados agentes para evitar a formação de espumas que inibam as lamas activadas.

As lamas que se depositarem em torno do topo do recipiente de arejamento (C), [e no ensaio de confirmação da OCDE, na base do recipiente de decantação (D) e no circuito de circulação] devem ser de novo misturadas com o licor misto pelo menos uma vez por dia mediante raspagem ou qualquer outro meio adequado.

Quando as lamas já não conseguirem depositar-se, a sua densidade pode ser aumentada adicionando fracções de 2 ml de uma solução de cloreto de ferro a 5%, quantas vezes for necessário.

O efluente é recolhido no recipiente (E ou F) durante vinte a vinte e quatro horas e colhe-se uma amostra depois de o misturar cuidadosamente. Deve-se proceder a uma cuidadosa limpeza do recipiente (E ou F).

Para vigiar e controlar a eficiência do processo mede-se a carência química de oxigénio (CQO) ou o carbono orgânico dissolvido (COD) do filtrado do efluente acumulado pelo menos duas vezes por semana e igualmente do afluente filtrado [utilizando uma membrana de porosidade igual a 0,45 (mi)m, são rejeitados (aproximadamente) os primeiros 20 ml do filtrado].

A redução de CQO e COD deve estabilizar-se quando se atingir uma degradação diária regular.

O teor das lamas activadas em matéria seca no recipiente de arejamento deve ser determinado duas vezes por semana (em g/l). Pode-se fazer funcionar as unidades de uma das duas seguintes maneiras: determinar duas vezes por semana quer o teor em matéria seca das lamas activadas e no caso de ser superior a 2,5 g/l retirar as lamas activadas em excesso quer retirar diariamente 500 ml de licor misto de cada recipiente de modo a obter um tempo de retenção médio das lamas de seis dias.

Quando os parâmetros estimados e medidos [eficiência do processo (em termos de remoção de CQO e COD), concentração das lamas, decantabilidade das lamas, turvação dos efluentes, etc,] das duas unidades são suficientemente estáveis, a substância de ensaio pode ser adicionada ao afluente de uma das unidades, seguindo o ponto 1.6.2.2.

A substância de ensaio pode ser adicionada, alternativamente, no início do período de crescimento das lamas (1.6.2.1), em especial quando as lamas são introduzidas como inóculo.

1.6.2.2. Método de ensaio

Mantêm-se as condições de funcionamento do período inicial e adiciona-se ao afluente da unidade de ensaio uma quantidade suficiente de solução-mãe (aproximadamente 1%) da substância de ensaio de modo a que se obtenha a concentração desejável da substância de ensaio (aproximadamente 10 a 20 mg COD/l ou 40 mg CQO/l) nas águas residuais, o que pode ser feito misturando diariamente a solução-mãe nas águas residuais ou mediante um sistema de bombagem separado. Esta concentração pode ser atingida progressivamente. Se não se verificarem efeitos tóxicos da substância de ensaio sobre as lamas activadas podem experimentar-se concentrações mais elevadas.

A unidade em branco é alimentada apenas com afluente isento de substâncias adicionadas. Colhem-se volumes adequados de efluentes para análise e filtram-se através de filtros de membrana (045 (mi)m), rejeitando os primeiros 20 ml (aproximadamente) de filtrado.

As amostras filtradas devem ser analisadas no próprio dia ou então devem ser conservadas mediante qualquer método adequado, por exemplo, utilizando 0,05 ml de uma solução de cloreto mercúrico (HgCl(índice2)) a 1% por cada 10 ml de filtrado ou armazenando o filtrado entre 2 a 4ºC até um máximo de 24 horas ou abaixo de - 18ºC para períodos de tempo mais longos.

O período ao longo do qual se estende a experiência, que inclui a adição da substância de ensaio, não deve ultrapassar seis semanas e o período de avaliação não deve ser inferior a três semanas, ou seja, deve-se poder dispor de cerca de 14 a 20 determinações para o cálculo do resultado final.

Interligação das unidades

A interligação das unidades obtém-se trocando entre si, uma vez por dia, 1,5 l de licor misto (incluindo lamas) proveniente dos recipientes de arejamento das lamas activadas de duas unidades. No caso das substâncias de ensaio serem fortemente adsorventes, retiram-se apenas 1,5 l do líquido sobrenadante dos recipientes de decantação e deitam-se para o recipiente com lamas activadas da outra unidade.

1.6.2.3. Análise

Para acompanhar o comportamento da substância, podem ser efectuados dois tipos de análise:

COD ou CQO

As concentrações de COD são determinadas em duplicado com o analisador de carbono e/ou os valores da CQO são determinados em conformidade com a referência (2).

Análise específica

As concentrações da substância de ensaio são determinadas mediante um método analítico adequado. Sempre que possível, deve efectuar-se uma determinação específica da substância adsorvida nas lamas.

2.1. Interligação das unidades

Quando se utiliza a interligação das unidades calculam-se as taxas de remoção TR diárias em % de acordo com 1.2.1.

Estas taxas de remoção TR diárias são corrigidas em termos de TRc para o material transferido devido ao processo de transinoculação através da equação [2] para um tempo de retenção médio de três horas ou da equação [3] para um tempo de retenção médio de 6 horas.

TRc = (8/7) TR - (100/7) [2]

TRc = (4/3) TR - (100/3) [3]

Calcula-se a media das séries dos valores TRc e ainda o desvio padrão de acordo com a equação 4:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

Rejeitam-se os valores discrepantes das séries TRc segundo um processo estatístico adequado, por exemplo, o de Nalimov [6] para um nível de probabilidade de 95% e calcula-se de novo a média e o desvio padrão do conjunto de dados TRc sem os valores discrepantes.

Calcula-se então o resultado final recorrendo à equação [5]:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

O resultado é expresso pela média com limites de tolerância ao nível de probabilidade de 95%, o desvio padrão e o número de dados da série das TRc menos os valores discrepantes, e o número de valores discrepantes, por exemplo:

TRc = 98,6 (mais ou menos) 2,3% da remoção de COD,

s = 4,65% da remoção de COD,

n = 18,

x = número de valores discrepantes.

2.2. Unidades não interligadas

O rendimento das unidades pode ser verificado do seguinte modo:

% de remoção de CQO ou COD = (CQO ou COD das águas residuais - CQO ou COD do efluente / CQO ou COD das águas residuais) x 100

Esta remoção diária pode ser representada graficamente para permitir identificar qualquer tipo de tendência, por exemplo, climatização.

2.2.1. Utilização da determinação da CQO/COD

A taxa diária de remoção em % TR calcula-se segundo 1.2.1.

Calcula-se a média da série de valores TR e ainda o seu desvio padrão segundo a fórmula seguinte:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

Eliminam-se os valores discrepantes da série TR de acordo com um método estatístico adequado, por exemplo, o de Nalimov [6], ao nível de probabilidade de 95% e calcula-se de novo o desvio padrão da série de dados TR, menos os valores discrepantes.

O resultado final é calculado por meio de equação [7]:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

O resultado é expresso como a média com limites de tolerância ao nível de probabilidade de 95%, o respectivo desvio padrão e o número de dados da série dos TR menos os valores discrepantes, e o número de valores discrepantes, por exemplo:

TR = (98,6 (mais ou menos) 2,3%) de remoção de COD,

s = 4,65% de remoção de COD,

n = 18,

x = número de valores discrepantes.

2.2.2. Utilização de análise específica

Calcula-se a percentagem de eliminação da substância a ensaiar da fase aquosa (R(índice W)) de acordo com 1.2.2.

3.1. Relatório do ensaio

O relatório do ensaio, deve incluir, se possível, as seguintes informações:

• o formulário incluído no Anexo III, indicando as condições de funcionamento do ensaio,

• o equipamento escolhido (ensaio de confirmação da OCDE ou ensaio de vaso poroso),

• o modo de funcionamento escolhido: unidades interligadas ou não,

• as águas residuais: sintéticas ou domésticas,

• No caso das águas residuais domésticas: data e local de colheita da amostra,

• o inóculo com data e local de colheita da amostra,

• uma descrição do método de análise, se forem efectuadas análises específicas,

• a representação gráfica da remoção CQO ou COD em função do tempo durante a período inicial e o período de avaliação,

• recuperação analítica da substância de ensaio na forma de CQO ou COD na solução mãe,

• se foram efectuadas análises específicas, a representação gráfica da percentagem de remoção da substância a ensaiar da fase aquosa em função do tempo (período inicial e período da avaliação),

• a remoção média de COD ou de CQO da substância a ensaiar e o desvio padrão é calculado a partir dos resultados do período de avaliação, ou seja, quando há uma remoção regular da substância a ensaiar ou se verifica um período de funcionamento estacionário,

• a representação gráfica da concentração das lamas activadas em função do tempo,

• qualquer observação relativa às lamas activadas (rejeição de um excesso de lama, presença de um aglomerado, FeCl(índice 3), etc.),

• concentração da substância utilizada no ensaio,

• todos os resultados relativos à análise efectuada nas lamas,

• todas as informações e resultados experimentais relativos à substância ensaiada e, se fôr caso disso, à substância de referência,

• as razões científicas de quaisquer modificações da metodologia.

3.2. Interpretação dos resultados

Uma remoção baixa da substância ensaiada da fase aquosa pode ser devida a uma inibição dos microrganismos pela substância ensaiada, o que pode igualmente traduzir-se por uma lise e perda de lamas, dando origem a um sobrenadante turvo, e por uma diminuição da eficiência da instalação-piloto do ponto de vista da remoção do COD (ou CQO).

A adsorção físico-química pode por vezes, ter influência. As diferenças entre a acção biológica na molécula e a adsorção fisico-química podem ser reveladas por uma análise efectuada nas lamas após uma desorção adequada.

São necessários ensaios complementares, se se pretender estabelecer uma distinção entre biodegradação (ou biodegradação parcial) e adsorção, o que pode ser feito de diferentes maneiras, mas a mais conveniente consiste em utilizar o sobrenadante como inóculo num ensaio preliminar (de preferência ensaio respirométrico).

Se se observarem remoções acentuadas de COD ou CQO, estas são devidas a biodegradação enquanto que para às remoções baixas não é possível distinguir entre biodegradação e eliminação. Por exemplo, se um composto solúvel apresenta uma constante de adsorção elevada de 98% e se a taxa diária de rejeição de lamas excedentárias é de 10%, é possível uma eliminação que atinja 40% no máximo; para uma taxa de rejeição de lamas excedentárias de 30%, a eliminação devida à adsorção e à rejeição de lamas excedentárias pode atingir 65% (4).

No caso de uma análise específica, é conveniente ter em atenção a relação entre a estrutura da substância e a análise específica efectuada. Nesse caso, o fenómeno observado não pode ser interpretado como uma mineralização da substância.

(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 303 A, Decisão C(81) 30 final do Conselho.

(2) Annex V C9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Directiva 84/449/CEE da Comissão, Jornal Oficial das Comunidades Europeias n.º L 251 de 19. 9. 1984.

(3) Painter H. A., King E. F., WRC Porous-Pot method for assessing biodegradability, Techinical Report TR70, Junho 1978, Water Research Center, United Kingdom.

(4) Wierich, P., Gerike, P., The Fate of Soluble. Recalcitrant, and Adsorbing Compounds in Activated Sludge Plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 5, n.º 2, Junho 1981, pp. 161 a 171.

(5) Directivas 82/242/CEE e 82/243/CEE do Conselho, JO n.º L 109 de 22. 4. 1982 que altera as Directivas 73/404/CEE e 73/405/CEE do Conselho: Biodegradabilidade dos detergentes, Jornal Oficial das Comunidades Europeias n.º L 347 de 17. 12. 1973.

(6) Streuli. H., Feherhafte Interpretation und Anwendung von Ausrei(beta)ertests, insbesondere bei Ringversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fresenius-Zeitschrift für Analytische Chemie 303(1980), pp. 406 a 408.

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

BIODEGRADAÇÃO

LAMAS ACTIVADAS: ENSAIO DE INIBIÇÃO DA RESPIRAÇÃO

1.1 Introdução

O método descrito avalia o efeito da substância de ensaio sobre os microrganismos medindo a taxa respiratória em condições determinadas, na presença de diferentes concentrações da substância de ensaio.

O objectivo do presente método é fornecer um processo de selecção rápido que permita identificar as substâncias de ensaio que podem afectar negativamente o funcionamento das estações de tratamento microbiano aeróbio e indicar as concentrações adequadas não inibidoras das substâncias de ensaio a utilizar nas experiências de biodegradação.

Um ensaio (preliminar) pode preceder o ensaio final, o qual fornecerá informações relativas à gama de concentrações a utilizar no ensaio principal.

Além dos ensaios com a substância a estudar, incluem-se no protocolo experimental dois controlos, um no início e outro no final da série de experiências. Cada lote de lamas activadas deve igualmente ser testado utilizando uma substância de referência.

O presente método aplica-se sobretudo a substâncias que, em virtude da sua solubilidade na água e fraca volatilidade são susceptíveis de permanecer na água. Para as substâncias cuja solubilidade no meio do ensaio é limitada, pode não ser possível determinar a CE(índice 50).

Os resultados baseados no consumo de oxigénio podem conduzir a conclusões erróneas quando a substância de ensaio tem tendência a romper a fosforilação oxidativa.

Para efectuar o ensaio, é útil dispôr das seguintes informações:

• solubilidade na água,

• pressão de vapor,

• fórmula de estrutura,

• pureza da substância de ensaio.

Recomendação:

As lamas activadas podem conter organismos potencialmente patogénicos e devem ser manipuladas com prudência.

1.2. Definições e unidades

A taxa respiratória é o consumo de oxigénio dos microorganismos aeróbios contidos nas lamas das águas residuais, expresso geralmente em mg O(índice 2) por mg de lamas por hora.

Para calcular o efeito inibidor de uma substância de ensaio numa dada concentração; exprime-se a taxa respiratória sob a forma de percentagem da média:

(1 - (2R(índice s)/(Rc(índice 1) + Rc(índice 2)) x 100 = percentagem de inibição

em que:

R(índice s) = taxa de consumo de oxigénio da substância de ensaio a uma dada concentração,

Rc(índice 1) = taxa de consumo de oxigénio do controlo 1,

Rc(índice 2) = taxa de consumo de oxigénio do controlo 2.

Neste método, a CE(índice 50) é a concentração da substância de ensaio para a qual a taxa respiratória é 50% da verificada no controlo, nas condições descritas neste método.

1.3. Substâncias de referência

Recomenda-se a utilização como substância de referência do 3. 5-diclorofenol, um conhecido inibidor da respiração e para cada lote de lamas activadas, determina-se a CE(índice 50) dessa substância a fim de avaliar se a sensibilidade das lamas não é anormal.

1.4. Princípio do método de ensaio

Mede-se a taxa respiratória das lamas activadas alimentadas com uma quantidade padrão de águas residuais sintéticas após um tempo de contacto de 30 minutos ou de três horas, ou de ambos. Por outro lado, mede-se igualmente a taxa respiratória das mesmas lamas activadas em presença de diversas concentrações da substância de ensaio em condições idênticas. O efeito inibidor da substância de ensaio a uma determinada concentração é expresso como uma percentagem do valor médio das taxas respiratórias dos dois controlos. Calcula-se um valor de CE(índice 50) a partir das determinações feitas a diferentes concentrações.

1.5. Critérios de qualidade

Os resultados do ensaio são válidos se:

• as taxas respiratórias dos dois controlos não diferirem entre si mais de 15%,

• a CE(índice 50) (30 minutos e/ou três horas) do 3,5-diclorofenol se situa num intervalo aceitável de 5 a 30 mg/l.

1.6. Descrição do método de ensaio

1.6.1. Reagentes

1.6.1.1. Soluções da substância de ensaio

Preparam-se soluções frescas da substância de ensaio no início deste a partir de uma solução-mãe. É adequada uma solução-mãe com a concentração de 0,5 g/l quando se utiliza a metodologia a seguir indicada.

1.6.1.2. Solução da substância de controlo

Pode-se preparar, por exemplo, uma solução de 3,5-diclorofenol dissolvendo 0,5 g de 3,5 - diclorofenol em 10 ml de 1M NaOH, diluindo depois em água destilada até perfazer aproximadamente 30 ml e adicionando, ao mesmo tempo que se agita, 0,5 M H(índice 2)SO(índice 4) até ao início da precipitação - são necessários aproximadamente 8 ml de 0,5 M H(índice 2) SO(índice 4) - e por fim, dilui-se a mistura com água destilada até perfazer 1 litro. O pH deverá então estar compreendido entre 7 e 8.

1.6.1.3. Águas residuais sintéticas

Prepara-se uma alimentação de águas residuais sintéticas dissolvendo as seguintes quantidades de substâncias num litro de água:

• 16 g de peptona,

• 11 g de extracto de carne,

• 3 g de ureia,

• 0,7 g de NaCl,

• 0,4 g de CaCl(índice 2).2H(índice 2)O,

• 0,2 g de MgSO(índice 4).7H(índice 2)O,

• 2,8 g de K(índice 2)HPO(índice 4).

Nota 1: Esta água residual sintética é 100 vezes mais concentrada do que a descrita no relatório técnico da OCDE «Método proposto para a determinação da biodegradação dos agentes tensio-activos utilizados nos detergentes sintéticos», de 11 de Junho de 1976 com a adição de, hidrogenofosfato de dipotássio.

Nota 2: Se o meio que se preparou não for utilizado imediatamente, deve ser guardado em condições de obscuridade, à temperatura de 0 a 4ºC, por um período máximo de uma semana, em condições em que não se verifique qualquer alteração da sua composição.

Antes de se proceder ao seu armazenamento, o meio pode igualmente ser esterilizado ou proceder-se à adição da peptona e do extracto de carne um pouco antes de efectuar o ensaio. Antes de utilizar este meio, deve-se misturar completamente e ajustar-se o pH.

1.6.2. Equipamento

Aparelho de medição: não é essencial uma concepção específica do aparelho. Contudo, não deve existir qualquer espaço vazio por cima do líquido e o eléctrodo deve adaptar-se perfeitamente ao gargalo do frasco de medição.

É necessário um equipamento normal de laboratório e, especialmente os seguintes instrumentos:

• aparelho de medição,

• dispositivo de arejamento,

• eléctrodo e aparelho de medição do pH,

• eléctrodo de oxigénio.

1.6.3. Preparação do inóculo

Como inóculo microbiano para o ensaio, utilizam-se lamas activadas provenientes de uma estação de tratamento de águas resíduais que trate predominantemente águas residuais domésticas.

Se necessário, no laboratório, as partículas grosseiras podem ser removidas por sedimentação durante um curto período de tempo, por exemplo de 15 minutos, e decantando posteriormente o sobrenadante, contendo os sólidos mais finos, para ser utilizado no ensaio. Alternativamente, podem-se misturar as lamas durante alguns segundos recorrendo a um misturador.

Além disso, se se suspeitar que se encontram presentes substâncias inibidoras, as lamas devem ser lavadas com água da torneira ou com uma solução isotónica. Após centrifugação, o sobrenadante é decantado (repete-se este processo três vezes).

Pesa-se e seca-se uma pequena quantidade de lamas. A partir deste resultado, pode-se calcular a quantidade de lamas húmidas que devem ser dispersas em água de modo a obter lamas activadas com uma concentração de sólidos suspensos no licor misto entre 2 e 4 g/l. Este valor conduz a uma concentração no meio de 0,8 a 1,6 g/l se se seguir a metodologia abaixo recomendada.

Se as lamas não puderem ser utilizadas no próprio dia da sua colheita, adicionam-se 50 ml de águas residuais sintéticas a cada litro de lamas activadas preparadas da forma acima descrita e arejam-se durante a noite à temperatura de 20 (mais ou menos) 20ºC. Conservam-se arejadas para serem utilizadas durante o dia. Antes da sua utilização, verifica-se o pH e, se necessário, ajusta-se a pH 6,0 a 8,0: Os sólidos suspensos no licor misto devem ser determinados tal como foi descrito no parágrafo anterior.

Se for necessário utilizar o mesmo lote de lamas durante vários dias consecutivos (quatro dias no máximo) adiciona-se uma outra dose de 50 ml de água residual sintética por litro de lamas no final de cada dia de trabalho.

1.6.4. Execução do ensaio

Duração/tempo de contacto 30 minutos e/ou três horas, durante as quais o meio de ensaio é arejado

Agua água de beber (desclorada, se necessário)

Fornecimento de ar ar limpo, sem óleo. Caudal de ar de 0,5 a 1 l/minuto

Aparelho de medição frasco de fundo plano tal como o destinado à medição da DBO

Medidor de oxigénio eléctrodo de oxigénio adequado com um registador.

Solução nutritiva águas residuais sintéticas (ver acima)

Substância de ensaio a solução de ensaio fresca é preparada no início do ensaio

Substância de referência por exemplo, 3,5 diclorofenol (em pelo menos três concentrações)

Controlos: amostra inoculada, sem substância de ensaio.

Temperatura: 20 (mais ou menos) 2ºC.

Sugere-se seguidamente um método experimental que pode ser aplicado tanto à substância de ensaio como à substância de referência para um tempo de contacto de três horas.

Utilizam-se vários recipientes (por exemplo, provetas de um litro).

Devem-se utilizar pelo menos cinco concentrações, espaçadas entre si por um factor constante que, de preferência, não deve ultrapassar 3,2.

No instante «O», a 16 ml de água residual sintética adiciona-se água até prefazer 300 ml. juntam-se 200 ml de inóculo microbiano e deita-se a mistura (500 ml) para um primeiro recipiente (primeiro controlo C(índice 1).

Os recipientes de ensaio devem ser continuamente arejados de modo a garantir que o O(índice 2) dissolvido não desça abaixo de 2,5 mg/l e que imediatamente antes da medição da taxa respiratória, a concentração de O(índice 2) seja de cerca de 6,5 mg/l.

Ao fim de 15 minutos (15 minutos é um intervalo arbitrário, mas conveniente), repete-se o procedimento anterior com a excepção de que se adicionam 100 ml da solução de reservada substância de ensaio a 16 ml de água residual sintética, antes de proceder à adição de água até perfazer 300 ml e do inóculo microbiano até aos 500 ml. Esta mistura é em seguida deitada para um segundo recipiente e arejada tal como anteriormente. Repete-se este procedimento de quinze em quinze minutos com diferentes volumes da solução-mãe da substância de ensaio a fim de obter uma série de recipientes com diferentes concentrações da substância de ensaio. Por fim, prepara-se um segundo controlo (C(índice 2)).

Ao fim de três horas regista-se o pH, deita-se uma amostra bem misturada do conteúdo do primeiro recipiente no aparelho de medição e mede-se a taxa respiratória durante um período máximo de 10 minutos.

Repete-se esta determinação com o conteúdo de cada recipiente a intervalos de quinze minutos de modo a que o tempo de contacto em cada recipiente seja de três horas.

A substância de referência é ensaiada de modo idêntico com cada lote de inóculo microbiano.

Será necessário um processo diferente (por exemplo, mais do que um aparelho de medição de oxigénio) quando se efectuarem as medições após 30 minutos de contacto.

Se for necessário determinar o consumo de oxigénio, preparam-se recipientes suplementares contendo a substância de ensaio, água residual sintética e água, mas sem lamas activadas.

O consumo de oxigénio é medido e registado após um tempo de arejamento de 30 minutos e/ou três horas (tempo de contacto).

A taxa respiratória calcula-se a partir do traçado do registador para as medições compreendidas aproximadamente entre 6,5 mg de O(índice 2)/l e 2,5 mg de O(índice 2)/l ou durante um período de dez minutos quando a taxa respiratória é baixa. A parte da curva respiratória sobre a qual se mede a taxa respiratória deve ser linear.

Se as taxas respiratórias dos dois controlos diferirem entre si de mais de 15% ou se a CE(índice 50) (30 minutos e/ou três h) da substância de referência não se encontrar no intervalo aceitável (5 a 30 mg/l para o 3,5 - diclorofenol), o ensaio não é válido e deve ser repetido.

Calcula-se a percentagem de inibição para cada concentração de ensaio (ver 1.2). Representa-se graficamente em papel log-normal (ou log-probabilidade), a percentagem de inibição em função da concentração e deduz-se o valor de CE(índice 50).

Podem ser determinados os intervalos de confiança a 95% para os valores de CE(índice 50) segundo os métodos normalmente utilizados.

3.1. Relatório do ensaio

O relatório do ensaio deve incluir, se possível, as seguintes informações:

• Substância de ensaio: dados de identificação química.

• Sistema de ensaio: origem, concentração e eventual tratamento prévio das lamas activadas.

• Condições de ensaio:

• pH da mistura de reacção antes da medição da respiração,

• temperatura de ensaio,

• duração do ensaio,

• substância de referência e respectiva CE(índice 50),

• consumo abiótico de oxigénio (se se verificar).

• Resultados:

• todos os dados determinados,

• curva de inibição e método de cálculo da CE(índice 50),

• CE(índice 50) e, se possível, intervalos de confiança a 95%, CE(índice 20) e CE(índice 80),

• todas as observações e quaisquer desvios em relação ao presente método de ensaio que poderiam ter influenciado os resultados.

3.2. Interpretação dos resultados

O valor da CE(índice 50) deve ser apenas considerado como uma indicação da toxicidade provável da substância de ensaio quer para o tratamento das águas residuais por lamas activadas quer para os microrganismos das águas residuais, uma vez que as complexas interacções que se verificam no ambiente não podem ser simuladas com precisão num ensaio de laboratório. Além disso, as substâncias de ensaio que podem ter um efeito inibidor na oxidação do amoníaco podem também produzir curvas de inibição atípicas. Por conseguinte, tais curvas devem ser cuidadosamente interpretadas.

(1) Internacional Standard ISO 8192 - 1986

(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.

(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.

(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries) Recommended Method n.º 103, also described by:

(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.

(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.

(7) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decisão C(81) 30 final do Conselho.

BIODEGRADAÇÃO

ENSAIO L.A.S.C. MODIFICADO

1.1. Introdução

O objectivo de método é avaliar a biodegradação final potencial de substâncias orgânicas solúveis em água e não voláteis quando expostas a concentrações relativamente elevadas de microrganismos durante um longo período de tempo. Durante este período, a viabilidade dos microrganismos é mantida através da adição diária de uma alimentação de águas residuais decantadas. (Para conservação das águas residuais durante o fim de semana as mesmas poderão ser guardadas a 4ºC. Podem-se utilizar alternativamente as águas residuais sintéticas do ensaio de confirmação da OCDE.)

Pode verificar-se uma adsorção físico-química aos sólidos suspensos, o que deve ser tomado em consideração na interpretação dos resultados (ver 3.2).

Devido ao extenso período de retenção da fase líquida (36 horas) e à adição intermitente de nutrientes, o ensaio não simula as condições que ocorrem numa estação de tratamento de águas residuais. Os resultados obtidos com várias substâncias de ensaio indicam que o ensaio apresenta um elevado potencial de biodegradação.

As condições do ensaio são altamente favoráveis à selecção e/ou adaptação de microrganismos capazes de degradar o composto ensaiado. (O procedimento pode igualmente ser utilizado na produção de inóculos adaptados para utilização em outros ensaios).

No presente método, utiliza-se a medida da concentração de carbono orgânico dissolvido na avaliação da biodegradação final das substâncias de ensaio. É preferível determinar o COD após acidificação e purificação do que através da diferença de C(índice total) - C(índice inorgânico).

A utilização simultânea de um método analítico específico pode permitir a avaliação da degradação primária da substância (desaparecimento da estrutura química original).

O método apenas se aplica às substâncias orgânicas de ensaio que, nas concentrações utilizadas no ensaio:

• são solúveis em água (pelo menos 20 mg de carbono orgânico dissolvido/l),

• possuem uma pressão de vapor negligível,

• não adsorvem significativamente no sistema de ensaio,

• não se perdem na solução de ensaio devido a formação de espuma,

• não exercem efeitos inibidores sobre as bactérias.

Deve ser determinado o teor em carbono orgânico da substância de ensaio.

As informações respeitantes às proporções relativas dos componentes principais das substâncias de ensaio serão úteis na interpretação dos resultados obtidos, especialmente nos casos em que os resultados são baixos ou marginais.

As informações relativas à toxicidade da substância para os microrganismos pode ser útil na interpretação dos resultados baixos e na selecção das concentrações de ensaio adequadas.

1.2. Definições e unidades

C(índice E) = concentração do composto ensaiado em carbono orgânico presente ou adicionado às águas residuais decantadas no início do período de arejamento (mg/l),

C(índice e) = concentração do carbono orgânico dissolvido presente no licor sobrenadante do ensaio no final do período de arejamento (mg/l),

C(índice c) = concentração do carbono orgânico dissolvido presente no licor sobranadante do controlo no final do período de arejamento (mg/l).

No presente método a biodegradação é definida como o desaparecimento de carbono orgânico. A biodegradação pode ser expressa em:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

1.3. Substâncias de referência

Em alguns casos, quando se investiga uma nova substância, podem ser úteis substâncias de referência; contudo, não se recomenda aqui qualquer substância de referência específica.

Fornecem-se dados relativos a diversos compostos avaliados em ensaios de intercalibração (ver Apêndice I) de modo a que se possa fazer a calibração do método de tempos a tempos e a permitir a comparação dos resultados quando se utiliza outro método.

1.4. Princípio do método de ensaio

Numa unidade de lamas activadas semi-contínua (LASC), colocam-se lamas activadas provenientes de uma estação de tratamento de águas residuais. Adicionam-se o composto a ensaiar e as águas resíduais domésticas decantadas e a mistura é arejada durante 23 horas. Pára-se depois o arejamento, permitindo a sedimentação das lamas e retira-se o licor sobrenadante.

As lamas que permanecem no tanque de arejamento são então misturadas com outra alíquota do composto de ensaio e águas residuais e repete-se o processo.

Avalia-se a biodegradação através da determinação do teor em carbono orgânico dissolvido no licor sobrenadante. Compara-se este valor com o que se obtêm para o licor proveniente de um tubo de controlo contendo apenas águas residuais decantadas.

Quando se utiliza um método analítico específico, podem medir-se alterações na concentração da molécula original devido a biodegradação (Biodegradação primária).

1.5. Critérios de qualidade

A reprodutibilidade do presente método baseado na remoção do carbono orgânico dissolvido ainda não foi estabelecida. (Quando se considera a biodegradação primária, obtêm-se dados muito precisos para substâncias que são consideravelmente degradadas).

A sensibilidade do método é determinada em larga medida pela variabilidade do ensaio em branco e em menor extensão, pela precisão da determinação do carbono orgânico dissolvido e teor do composto de ensaio no licor, no início de cada ciclo.

1.6. Descrição do método de ensaio

1.6.1. Preparações

Ligam-se um número suficiente de unidades de arejamento limpas (pode-se utilizar alternativamente a unidade de ensaio de 1,51 de LASC inicial) e tubos para entrada do ar (figura 1) para cada substância de ensaio e controlo. O ar comprimido fornecido às unidades de ensaio, limpo através de um filtro de algodão, deve ser isento de carbono orgânico e pré-saturado com água de modo a reduzir as perdas por evaporação.

De uma estação de lamas activadas que trate predominantemente águas resíduais domésticas, retira-se uma amostra de licor misto contendo 1 a 4 g de sólidos suspensos/l. São necessários por cada unidade de arejamento cerca de 150 ml de licor misto.

Preparam-se soluções de reserva da substância de ensaio em água destilada; a concentração normalmente exigida é de 400 mg/l como carbono orgânico o que dá uma concentração no composto de ensaio de 20 mg/l de carbono no início de cada ciclo de arejamento se não se verificar biodegradação.

É possível utilizar concentrações mais elevadas se a toxicidade em relação aos microrganismos o permitir.

Mede-se o teor em carbono orgânico nas soluções de reserva.

1.6.2. Condições de ensaio

O ensaio deve efectuar-se a 20 a 25ºC.

Utiliza-se uma concentração elevada de microrganismos aeróbios (de 1 a 4 g/l de sólidos suspensos) e o período de retenção efectiva é de 36 horas. As substâncias carbonadas presentes nas águas residuais de alimentação, são largamente oxidadas, em geral no espaço de oito horas após o início de cada ciclo de arejamento. Em seguida, verifica-se uma respiração endógena das lamas durante o restante período de arejamento, no decurso do qual o único substracto disponível é o composto de ensaio a não ser que este seja também rapidamente metabolizado. Estas características associadas a uma reinoculação diária do ensaio quando são utilizadas como meio águas residuais domésticas fornecem condições altamente favoráveis tanto para a adaptação como para elevados graus de biodegradação.

1.6.3. Execução do ensaio

Retira-se uma amostra de licor misto de uma unidade laboratorial ou estação de lamas activadas predominantemente doméstica e conserva-se em condições aeróbias até ser utilizada no laboratório. Cada uma das unidades de arejamento e de controlo são cheios com 150 ml de licor misto (se se utilizar a unidade de ensaio LASC, multiplicar por 10 os volumes dados) e dá-se início ao arejamento. Após 23 horas, interrompe-se o arejamento e deixam-se sedimentar as lamas durante 45 minutos. Abrem-se sucessivamente as torneiras de cada um dos recipientes e rejeitam-se fracções de 100 ml do licor sobrenadante. Recolhe-se uma amostra de águas residuais domésticas decantadas imediatamente antes da utilização e adicionam-se 100 ml às lamas remanescentes em cada unidade de arejamento. Recomeça-se de novo o arejamento. Nesta fase, não se adicionam quaisquer substâncias de ensaio e as unidades são diariamente alimentadas com águas residuais domésticas apenas até ao momento em que se obtém na decantação um licor sobrenadante límpido. Este processo demora geralmente duas semanas, no fim das quais o carbono orgânico dissolvido no licor sobrenadante no final de cada ciclo de arejamento se aproxima de um valor constante.

No final deste período, misturam-se as lamas decantadas separadamente e adicionam-se a cada unidade 50 ml das lamas compostas resultantes.

Adicionam-se às unidades de controlo 95 ml de águas residuais decantadas mais 5 ml de água e ás unidades de ensaio 95 ml mais 5 ml da solução adequada de reserva do composto de ensaio (400 mg/l). Recomeça-se de novo o arejamento que prossegue durante 23 horas. Deixam-se então sedimentar as lamas durante 45 minutos e o sobrenadante é retirado e analisado o seu teor em carbono orgânico dissolvido.

Este processo de enchimento e esvaziamento é repetido diariamente ao longo do ensaio.

Antes da sedimentação pode ser necessário limpar as paredes das unidades de modo a evitar a acumulação de sólidos acima do nível do líquido. Para evitar uma contaminação cruzada, utilizam-se raspadores ou escovas individuais para cada unidade.

O ideal seria determinar diariamente o carbono orgânico dissolvidos nos licores sobrenadantes, embora sejam admissíveis análises menos frequentes. Antes da análise, os licores são filtrados através de filtros limpos de membrana de 0,45 mm ou centrifugados. Os filtros de membrana são adequados se se garantir que nem libertam carbono nem absorvem a substância durante o processo de filtração. A temperatura da amostra não deve exceder 40ºC quando se encontra na centrífuga.

A duração do ensaio para compostos que apresentam uma biodegradação fraca ou nula é indeterminada, mas a experiência sugere que deve ser, em geral, de pelo menos 12 semanas, mas nunca mais de 26 semanas.

Representam-se graficamente, em função do tempo, os valores de carbono orgânico dissolvido nos licores sobrenadantes das unidades de ensaio e das unidades de controlo.

À medida que ocorre a biodegradação, o nível obtido no ensaio aproximar-se-á do obtido no controlo. Quando se verificar que a diferença entre os dois níveis é constante ao longo de três medições consecutivas, efectua-se o número de medições posteriores que seja necessário para permitir o tratamento estatístico dos dados e calcula-se a percentagem de biodegradação do composto de ensaio [D(índice ad), D(índice sid), ver 1.2].

3.1. Relatório do ensaio

O relatório do ensaio, deve incluir, se possível, as seguintes informações:

• todas as informações relativas à natureza das águas residuais, tipo de unidade utilizada e resultados experimentais respeitantes à substância ensaiada, substância de referência se utilizada e ensaio em branco,

• a temperatura,

• a curva de remoção com a descrição e processo de cálculo (ver 1.2),

• data e local onde foram recolhidas as lamas activadas e as águas residuais, estado de adaptação, concentração, etc.,

• razões científicas de quaisquer alterações da metodologia,

• assinatura e data.

3.2. Interpretação dos resultados

Uma vez que a substância a ser ensaiada através do presente método não será imediatamente biodegradável, qualquer remoção do COD devido apenas à biodegradação será normalmente gradual ao longo de vários dias ou semanas, excepto nos casos em que a adaptação é repentina, tal como é indicado por uma remoção abrupta que ocorra após algumas semanas.

Todavia, a adsorção físico-química pode, por vezes, desempenhar um papel importante; isto verifica-se quando há uma remoção total ou parcial do COD adicionado no início. O que acontece posteriormente depende de factores tais como os graus de adsorção e a concentração dos sólidos em suspensão no efluente rejeitado. Em geral, a diferança entre a concentração de COD nos licores sobrenadantes do controlo e do ensaio aumenta gradualmente a partir de um valor inicial baixo e esta diferença mantém-se então ao nível do novo valor durante o resto da experiência, a menos que tenha lugar a adaptação.

Se for necessário estabelecer uma distinção entre biodegradação (ou biodegradação parcial) e adsorção, são necessários outros ensaios. Esta distinção pode ser obtida de diferentes modos mas o mais convincente é utilizar como inóculo o licor sobrenadante, ou as lamas, num método de base (de preferência um ensaio respirométrico).

As substâncias de ensaio que no presente ensaio apresentam remoções elevadas de COD não devidas a adsorção, devem ser consideradas como potencialmente biodegradáveis.

Uma remoção parcial não devida a adsorção indica que a substância é sujeita pelo menos a alguma biodegradação. Uma remoção baixa ou nula de COD pode ser devida a inibição dos microrganismos pela substância de ensaio e isto pode também ser demonstrado pela lise e perda de lamas, dando origem a sobrenadantes turvos. O ensaio deve ser repetido, utilizando um concentração mais baixa de substância de ensaio.

A utilização de um método analítico específico ou da substância de ensaio marcada com (elevado a 14)C pode permitir uma maior sensibilidade. No caso do composto de ensaio marcado com (elevado a 14)C, a recuperação de (elevado a 14)CO(índice 2) confirmará que se verificou biodegradação.

Quando os resultados se expressam também em termos de biodegradação primária, deve ser fornecida, se possível, uma explicação relativa à alteração de estrutura química que conduz à perda de resposta da substância de ensaio original.

A validação do método analítico deve ser fornecida conjuntamente com a resposta obtida no ensaio em branco.

(1) OCDE, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, Decisão C(81) 30 final do Conselho.

Apêndice 1

Ensaio L.A.S.C.: EXEMPLOS DE RESULTADOS

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))

Apêndice 2

Exemplo de equipamento

Figura 1

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1989/02/04201/00070122.pdf))