Portaria n.º 467/90 — Estabelece as normas técnicas de execução regulamentar relativas às condições gerais e especiais a que obedecem a…

1.5 - Um dispositivo experimental de sete orifícios isentos de humidade deve ser realizado por perfuração da gelose até ao fundo da placa; esta rede é constituída por um orifício central, à volta do qual se dispõem seis orifícios periféricos, dispostos em círculo. Com um molde de punção para sete orifícios, um centro e seis periféricos dispostos em círculo, perfurar a placa de gelose até ao fundo e retirar a humidade dos orifícios.

Diâmetro do orifício central: 4 mm.

Diâmetro dos orifícios periférios: 6 mm.

Distância entre os orifícios centrais e periféricos: 3 mm.

1.6 - O orifício central deve ser cheio de antigénio padrão. Os orifícios periféricos 1 e 4 (v. esquema abaixo) são cheios com o soro positivo conhecido, os orifícios 2, 3, 5 e 6 com os soros a testar. Os orifícios devem ser cheios até ao desaparecimento do menisco.

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1990/06/14200/26182632.pdf))

1.7 - As quantidades depositadas são as seguintes:

Antigénio: 32 (mi)l.

Soro de controlo: 73(mi)l.

Soro a testar: 73(mi)l.

1.8 - A incubação deve durar 72 horas à temperatura ambiente (20ºC-27ºC), num local húmido fechado.

1.9 - A prova pode ser lida às 24 horas e depois às 48 horas, mas nenhum resultado final pode ser obtido antes das 72 horas.

1.9.1 - Um soro a testar é positivo se forma uma linha de precipitação específica com o antigénio do vírus de leucose bovina, ou se esta linha se continua com a do soro de controlo.

1.9.2 - Um soro a testar é negativo se não dá uma linha de precipitação específica com o antigénio do vírus da leucose bovina, ou se não intersecta a linha do soro de controlo.

1.9.3 - A prova não será considerada conclusiva se:

1.9.3.1 - Inflecte a curva do soro de controlo para o orifício do antigénio do vírus da leucose bovina sem formar uma curva de precipitação visível com o antigénio; ou

1.9.3.2 - Se não for possível interpretá-la como negativa ou como positiva.

Para as provas não conclusivas, tem de se repetir a prova e utilizar soro concentrado.

2 - Método de padronização do antigénio:

Soluções e materiais necessários:

2.1 - 40 ml de gelose a 1,6% num tampão TRIS 0,05 M/HCL, pH 7,2 com 8,5% de Na Cl;

2.2 -15 ml de um soro de leucose bovina, não possuindo anticorpos senão em relação às glicoproteínas do vírus da leucose bovina, soro diluído a 1:10 num tampão TRIS 0,05 M/HCL, pH 7,2 com 8,5% de Na Cl;

2.3 - 15 ml de um soro de leucose bovina, não possuindo anticorpos senão em relação às glicoproteínas do vírus da leucose bovina, soro diluído a 1:15 num tampão TRIS 0,05 M/HCL, pH 7,2 com 8,5% de Na Cl;

2.4 - Quatro placas de Petri, em matéria plástica, com diâmetro de 85 mm;

2.5 - Um punção de 4 a 6 mm de diâmetro;

2.6 - Um antigénio de referência;

2.7 - O antigénio a padronizar;

2.8 - Um banho-maria (56ºC).

Modo operatório:

Dissolver a gelose (1,6%) no tampão TRIS/HCL, aquecendo com precaução até 100ºC;

Regular o banho-maria para 56ºC, para cerca de uma hora;

Colocar as diluições do soro da leucose bovina no banho-maria a 56ºC;

Misturar, em seguida, 15 ml da solução de gelose a 56ºC com os 15 ml de soro da leucose bovina (1:10), agitar rapidamente e verter em duas placas de Petri, à razão de 15 ml por placa;

Recomeçar as operações anteriormente descritas com o soro da leucose bovina diluído a 1:5.

Quando a gelose estiver solidificada, os orifícios são praticados da seguinte forma:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1990/06/14200/26182632.pdf))

Adição dos antigénios

1 - Placas de Petri n.os 1 e 3:

Orifício A = antigénio de referência, não diluído;

Orifício B = antigénio de referência diluído a 1:2;

Orifício C + E = antigénio de referência;

Orifício D = antigénio a testar, não diluído.

2 - Placas de Petri n.os 2 e 4:

Orifício A = antigénio a testar, não diluído;

Orifício B = antigénio a testar, diluído a 1:2;

Orifício C = antigénio a testar, diluído a 1:4;

Orifício D = antigénio a testar, diluído a 1:8.

Instruções complementares:

2.1 - A experiência deve ser efectuada com duas diluições do soro (1:5 e 1:10), a fim de obter a precipitação óptima.

2.2 - Se o diâmetro de precipitação é demasiado fraco, para cada uma das duas diluições, o soro deve ser objecto de uma diluição suplementar.

2.3 - Se o diâmetro de precipitação é excessivo, para as duas diluições, e se o precipitado desaparece, deve ser escolhida uma diluição mais fraca para o soro.

2.4 - A concentração final da gelose deve estabelecer-se a 0,8% e a dos soros a 5% e a 10%, respectivamente.

2.5 - Anotar os diâmetros medidos. A diluição de trabalho é aquela em que se regista o mesmo diâmetro para o antigénio atestar e para o antigénio de referência.

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1990/06/14200/26182632.pdf))

ANEXO H — Leite

1 - Todas as análises de leite devem ser efectuadas nos laboratórios oficiais ou oficialmente acreditados.

2 - As amostras de leite devem ser colhidas nas seguintes condições:

2.1 - Os tetos devem ser previamente desinfectados com álcool a 70%.

2.2 - Durante a colheita, esterilizados os tubos, devem ser mantidos em posição inclinada.

2.3 - As amostras de leite devem ser colhidas no início da ordenha, após eliminação dos primeiros jactos, de cada teto.

2.4 - A amostra deve ser colhida em cada quarto, não podendo ser misturada.

2.5 - Cada amostra deve comportar no mínimo 10 ml de leite.

2.6 - Se for necessário utilizar um conservador, deve escolher-se o ácido bórico a 0,5%.

2.7 - Cada tubo deve ser munido de uma etiqueta com as seguintes indicações:

• O número da marca auricular ou qualquer outra forma de identificação do animal;

• A designação do quarto;

• A data e a hora da colheita da amostra.

2.8 - As amostras são acompanhadas de um documento com as seguintes indicações:

• O nome e a morada do médico veterinário oficial;

• O nome e a morada do proprietário;

• Os elementos de identificação do animal;

• A fase de lactação.

3 - A análise do leite deve ser praticada, pelo menos, nos 30 dias que antecedem o embarque e deve sempre comportar um exame bacteriológico, assim como um white-side-test (WST) ou Califórnia-mastite-test (TCM). Os resultados destes dois exames devem ser negativos, respeitando, no entanto, as seguintes disposições:

3.1 - Se o resultado do exame bacteriológico é positivo - mesmo na ausência de um estado inflamatório evidente - e o resultado do WST (ou do (TCM) é negativo, um segundo exame bacteriológico deve ser efectuado, no mínimo, 10 dias mais tarde, respeitando-se o período dos 30 dias acima indicados.

Neste segundo exame deve constatar-se:

3.1.1 - O desaparecimento dos agentes patogénicos.

3.1.2 - A ausência de antibióticos e do estado inflamatório por um WST (ou um TCM) que deve dar resultado negativo.

3.2 - Se o exame bacteriológico é negativo, enquanto o WST (ou o TCM) é positivo, deve proceder-se a um exame citológico completo que deve dar resultado negativo.

4 - O exame bacteriológico deve comportar:

4.1 - A sementeira do leite, em placa de Petri, em gelose sangue de boi ou de carneiro.

4.2 - A sementeira do leite em meio T. K. T. ou em meio d'Edwards. O exame bacteriológico deve visar a identificação de todo o germe patogénico e não pode limitar-se à evidenciação de estreptococos e estafilococos patogénicos. Com este objectivo a identificação das colónias suspeitas obtidas por sementeira, nos meios descritos, deve ser seguida pelas técnicas clássicas de diferenciação, tais como o emprego do meio selectivo para a detecção das enterobactérias.

5 - O exame citológico completo destina-se a evidenciar - no caso presente - um estado inflamatório típico independentemente de qualquer sintoma clínico.

É estabelecida a existência deste estado inflamatório, quando a contagem, leucocitária, segundo a técnica de Breed, atinge 1 milhão de leucócitos por mililitro e a relação entre mononucleados e polinucleados é inferior a 0,5.