Portaria n.º 1192/97 — Altera a Portaria n.º 503/94, de 6 de Julho (define os métodos de análise necessários ao controlo da composição dos…

Injectar 1 (mi)l do filtrado da amostra do n.º 6.1.1. Comparar o cromatograma com o de uma das soluções padrão (6.3.1). Se o pico apresentar um tempo de retenção sensivelmente análogo ao do ácido 2-metilpropiónico, mudar o padrão interno. Se não se observar interferência, injectar 1 (mi)l do filtrado da amostra do n.º 6.1.2 e medir as áreas do pico do ácido propiónico e do pico do padrão interno.

Fazer três injecções de cada solução e calcular a média das razões das áreas dos picos.

7 - Cálculos:

7.1 - A partir da curva de calibração obtida no n.º 6.3.1, determinar a razão e massas (K), correspondente à razão de áreas dos picos calculada no n.º 6.3.2.

7.2 - A partir da razão de massas obtida desta forma, calcular o teor (x) de ácido propiónico na amostra, em percentagem em massa, recorrendo à fórmula:

x% (m/m) = k(05.100.e/50.a) = k(e/a)

em que:

k = razão calculada no n.º 7.1;

e = massa, em gramas, do padrão interno pesado no n.º 4.6;

a = massa, em gramas, da amostra pesada no n.º 6.1.2.

Expressar o resultado com uma casa decimal.

8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):

Para um teor em ácido propiónico de 2% (m/m), a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar 0,12%.

CAPÍTULO XXXV

Hidroquinona, éter monometílico de hidroquinona, éter monoetílico de hidroquinona e éter monobenzílico de hidroquinona - Identificação e doseamento.

A - Identificação

1 - Objectivo e campo de aplicação:

Este método descreve a detecção e a identificação da hidroquinona, do éter monometílico de hidroquinona, do éter monoetílico de hidroquinona e do éter monobenzílico de hidroquinona (monobenzona) em produtos cosméticos para branqueamento da pele.

2 - Princípio:

A hidroquinona e os respectivos éteres são identificados por cromatografia em camada fina (TLC).

3 - Reagentes:

Os reagentes devem ser analiticamente puros.

3.1 - Etanol 96% (v/v).

3.2 - Clorofórmio.

3.3 - Éter dietílico

3.4 - Eluente:

Clorofórmio (3.2)/éter dietílico (3.3), 66:33 (v/v).

3.5 - Amónia, 25% (m/m) (d(índice 4)(elevado a 20) = 0,91 g/ml).

3.6 - Ácido ascórbico.

3.7 - Hidroquinona.

3.8 - Éter monometílico de hidroquinona.

3.9 - Éter monoetílico de hidroquinona.

3.10 - Éter monobenzílico de hidroquinona (monobenzona).

3.11 - Soluções padrão:

As seguintes soluções padrão devem ser preparadas de fresco e mantêm-se estáveis durante um dia:

3.11.1 - Pesar 0,05 g de hidroquinona (3.7) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Adicionar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6) e 5 ml de etanol a 96% (3.1).

Adicionar amónia (3.5) até pH 10 é perfazer o volume de 10 ml com etanol (3.1).

3.11.2 - Pesar 0,05 g de éter monometílico de hidroquinona (3.8) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Adicionar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6) e 5 ml de etanol (3.1). Adicionar amónia (3.5) até pH 10 e perfazer o volume de 10 ml com etanol (3.1).

3.11.3 - Pesar 0,05 g de éter monoetílico de hidroquinona (3.9) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Adicionar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6) e 5 ml de etanol (3.1). Adicionar amónia (3.5) até pH 10 e perfazer o volume de 10 ml com etanol (3.1).

3.11.4 - Pesar 0,05 g de éter monobenzílico de hidroquinona (3.10) num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Adicionar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6) e 5 ml de etanol (3.1). Adicionar amónia (3.5) até pH 10 e perfazer o volume de 10 ml com etanol (3.1).

3.12 - Nitrato de prata.

3.13 - Ácido 12-fosfomolíbdico.

3.14 - Ferrocianeto de potássio hexa-hidratado.

3.15 - Cloreto férrico hexa-hidratado.

3.16 - Reagentes para revelação:

3.16.1 - A uma solução aquosa de nitrato de prata (3.12) a 5% (m/v) adicionar amónia (3.5) até dissolução do precipitado formado.

Aviso. - A solução torna-se instável em repouso (risco de explosão) e deve ser eliminada após utilização.

3.16.2 - Solução a 10% (m/v) de ácido 12-fosfo-molíbdico (3.13) em etanol (3.1).

3.16.3 - Preparar uma solução aquosa de ferrocianeto de potássio (3.14) a 1% (m/v) e um soluto aquoso de cloreto férrico (3.15) a 2% (m/v). Misturar partes iguais de ambos os solutos imediatamente antes da utilização.

4 - Material e equipamento:

4.1 - Material corrente de laboratório.

4.2 - Equipamento convencional de TLC.

4.3 - Placas de TLC pré-preparadas: sílica gele GHR/UV(índice 254); 20 cm x 20 cm (Machery, Nagel ou equivalente); espessura da camada: 0,25 mm.

4.4 - Banho de ultra-sons.

4.5 - Centrífuga.

4.6 - Lâmpada UV, 254 nm.

5 - Técnica:

5.1 - Preparação da amostra:

Pesar 3,0 g da amostra num tubo de ensaio graduado de 10 ml. Adicionar 0,250 g de ácido ascórbico (3.6) e 5 ml de etanol (3.1). Ajustar a pH 10 com amónia (3.5). Perfazer o volume com etanol (3.1). Rolhar o tubo e homogeneizar num banho de ultra-sons durante dez minutos. Filtrar através de papel de filtro ou centrifugar a 3000 rpm.

5.2 - TLC:

5.2.1 - Saturar uma tina de cromatografia com o eluente (3.4).

5.2.2 - Depositar numa placa 2 (mi)l de solução padrão (3.11) e 2 (mi)l de solução da amostra (5.1). Eluir à temperatura ambiente ao abrigo da luz até que a frente do solvente tenha migrado 15 cm desde o ponto de partida.

5.2.3 - Retirar a placa e deixar secar à temperatura ambiente.

5.3 - Detecção:

5.3.1 - Observar a placa à luz UV a 254 nm e assinalar a posição das manchas.

5.3.2 - Nebulizar a placa com:

Reagente de nitrato de prata (3.16.1); ou

Reagente de ácido fosfomolíbdico (3.16.2); aquecer aproximadamente até 120ºC; ou

Solução de ferrocianeto de potássio e solução de cloreto férrico (3.16.3).

6 - Identificação:

Calcular o valor de Rf para cada mancha.

Comparar as manchas obtidas para a solução da amostra com as obtidas a partir das soluções padrão relativamente a: valores de Rf; cor das manchas sob radiação UV; cor das manchas após visualização reveladora.

Executar a técnica de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) descrita na parte B e comparar os tempos de retenção obtidos para o(s) pico(s) da solução da amostra com os das soluções padrão.

Relacionar os resultados obtidos pelas técnicas TLC e HPLC para identificar a presença de hidroquinona e ou dos respectivos éteres.

7 - Observações:

Nas condições descritas, observam os seguintes valores de Rf:

Hidroquinona - 0,32;

Éter monometílico de hidroquinona - 0,53;

Éter monoetílico de hidroquinona - 0,55;

Éter monobenzílico de hidroquinona - 0,58.

B - Doseamento

1 - Objectivo e campo de aplicação:

Este método descreve o doseamento da hidroquinona, do éter monometílico de hidroquinona, do éter monoetílico de hidroquinona e do éter monobenzílico de hidroquinona em produtos cosméticos para branqueamento da pele.

2 - Princípio:

A amostra é extraída com uma mistura água/metanol, com aquecimento suave, para fundir quaisquer lípidos presentes. O doseamento é realizado por cromatografia líquida de fase reversa com detecção UV.

3 - Reagentes:

3.1 - Os reagentes devem ser analiticamente puros. A água utilizada deve ser destilada a/ou pelo menos de pureza equivalente.

3.2 - Metanol.

3.3 - Hidroquinona.

3.4 - Éter monometílico de hidroquinona.

3.5 - Éter monoetílico de hidroquinona.

3.6 - Éter monobenzílico de hidroquinona (monobenzona).

3.7 - Tetra-hidrofurano para HPLC.

3.8 - Mistura água/metanol 1:1 (v/v). Misturar 1 volume de água e 1 volume de metanol (3.2).

3.9 - Fase móvel: mistura de tetra-hidrofurano/água 45:55 (v/v). Misturar 45 volumes de tetra-hidrofurano (3.7) e 55 volumes de água.

3.10 - Solução padrão:

Pesar 0,06 g de hidroquinona (3.3), 0,08 g de éter monometílico de hidroquinona (3.4), 0,10 g de éter monoetílico de hidroquinona (3.5) e 0,12 g de éter monobenzílico de hidroquinona (3.6) para num balão volumétrico de 50 ml. Dissolver e perfazer o volume com metanol (3.2). Preparar a solução padrão diluindo 10,00 ml desta solução para 50,00 ml com a mistura água/metanol (3.8).

Estas soluções têm de ser preparadas de fresco.

4 - Material e equipamento:

Material corrente de laboratório:

4.1 - Banho-maria a 60ºC.

4.2 - Cromatógrafo de fase líquida de alta resolução (HPLC) com um detector de UV de comprimento de onda variável e um dispositivo de injecção de 10 (mi)l de loop.

4.3 - Coluna:

Coluna cromatográfica de aço inoxidável, de 250 mm de comprimento, diâmetro interno de 4,6 mm, com enchimento de fenil Zorbax (fenetilsilano ligado quimicamente em Zorbax SIL, com os grupos silanol livres derivatizados com trimetilclorosilano partículas de 6 mm, ou equivalente). Não utilizar pré-colunas, com excepção das pré-colunas do tipo fenil ou equivalente.

4.4 - Papel de filtro, diâmetro de 90 mm, Schleicher & Schull, Weissband n.º 5892 ou equivalente.

5 - Técnica:

5.1 - Preparação da amostra:

Pesar com a exactidão de três casas decimais 1 g(mais ou menos)0,1 g (a gramas) de amostra num balão volumétrico de 50 ml. Dispersar a amostra em 25 ml de mistura água/metanol (3.8). Fechar o recipiente e agitar vigorosamente até obter uma suspensão homogénea. Agitar durante pelo menos um minuto. Colocar o recipiente em banho-maria (4.2) a 60ºC, a fim de aumentar a extracção. Arrefecer o recipiente e perfazer o volume com a mistura água/metanol (3.8). Filtrar o extracto com papel de filtro (4.4).

Executar a determinação HPLC nas vinte e quatro horas subsequentes à preparação do extracto.

5.2 - Cromatografia líquida de alta resolução (HPLC):

5.2.1 - Ajustar o fluxo da fase móvel (3.9) para 1,0 ml/min. e fixar o detector de comprimento de onda em 295 nm.

5.2.2 - Injectar 10 (mi)l da solução da amostra, obtida conforme descrito no n.º 5.1, e registar o cromatograma. Medir as áreas dos picos.

Calibrar conforme descrito no n.º 5.2.3. Comparar os cromatogramas obtidos para as soluções amostra e padrão. Utilizar as áreas dos picos e os factores da resposta (RF) calculados no n.º 5.2.3 para determinar a concentração das substâncias a analisar na solução da amostra.

5.2.3 - Calibração:

Injectar 10 (mi)l da solução padrão (3.10) e registar o cromatograma. Injectar várias vezes até obter uma área de pico constante.

Determinar o factor resposta RF(índice i):

RF(índice i) = p(índicei)/c(índice i)

em que:

p(índice i) = área do pico de hidroquinona, éter monometílico de hidroquinona, éter monoetílico de hidroquinona ou éter monobenzílico de hidroquinona;

c(índice i) = concentração (gramas por 50 ml) na solução padrão (3.10) de hidroquinona, éter monotílico de hidroquinona, éter monoetílico de hidroquinona ou éter metílico de hidroquinona, éter monoetílico de hidroquinona ou éter monobenzílico de hidroquinona.

Verificar se os cromatogramas obtidos para as soluções padrão e amostra obedecem aos seguintes requisitos:

A separação de picos do par de picos pior separados deve ser, no mínimo, de 0,90 (para definição da separação de picos, v. figura 1):

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1997/11/271b00/63276343.pdf))

Se não se obtiver a separação necessária, haverá que utilizar uma coluna mais eficaz ou adaptar a composição da fase móvel até serem alcançadas as condições pretendidas;

O factor de assimetria A(índice s) de todos os picos obtidos deve situar-se na gama 0,9 a 1,5 (para definição do factor de assimetria de picos, v. figura 2). Para registar o cromatograma com vista à determinação do factor de assimetria, recomenda-se uma velocidade de registo de pelo menos 2 cm/min.:

([ver documento original](https://files.diariodarepublica.pt/1s/1997/11/271b00/63276343.pdf))

Deverá obter-se uma linha de base estável.

6 - Cálculo:

Utilizar as áreas dos picos das substâncias a analisar para calcular as respectivas concentrações na amostra. Calcular a concentração da substância a analisar na amostra, em percentagem por massa (x), por meio da seguinte fórmula:

X(índice i)% (m/m) = (b(índice i) x 100)/(RF(índice i).a)

em que:

a = massa da amostra, em gramas;

bi = área de pico da substância i a analisar na amostra;

RF(índice i) = factor de resposta.

7 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):

7.1 - Para um teor de hidroquinona de 2,0%, a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,13%.

7.2 - Para um teor de éter monometílico de hidroquinona de 1,0%, a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,1%.

7.3 - Para um teor de éter monoetílico de hidroquinona de 1,0%, a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,11%.

7.4 - Para um teor de éter monobenzílico de hidroquinona de 1,0%, a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas em paralelo na mesma amostra não deve exceder um valor absoluto de 0,11%.

8 - Reprodutibilidade (segundo a norma ISO 5725):

8.1 - Para um teor de hidroquinona de 2,0%, a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores, material e ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,37%.

8.2 - Para um teor de éter monometílico de hidroquinona de 1,0%, a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores, material e ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,21%.

8.3 - Para um teor de éter de monoetílico de hidroquinona de 1,0%, a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores, material e ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,19%.

8.4 - Para um teor de éter monobenzílico de hidroquinona de 1,0%, a diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma amostra em condições diferentes (laboratórios, operadores, material e ou tempo de execução diferentes) não deve exceder um valor absoluto de 0,11%.

9 - Observações:

9.1 - Quando se determinar um teor de hidroquinona consideravelmente superior a 2% e for necessário um cálculo exacto, o extracto da amostra (5.1) deve ser diluído até atingir uma concentração idêntica à que seria obtida com uma amostra com um teor de hidroquinona de 2% e a determinação repetida (com alguns equipamentos, a absorvência pode situar-se fora da gama de linearidade do detector para concentrações elevadas de hidroquinona).

9.2 - Interferências:

O método acima descrito permite a determinação da hidroquinona e dos respectivos éteres com um único ciclo isocrático. A utilização da coluna de fenil garante uma retenção suficiente de hidroquinona, retenção essa que não pode ser garantida quando é utilizada uma coluna C18 com a fase móvel descrita.

No entanto, este método está sujeito a interferências devidas aos parabenos. Em tal caso, a determinação deve ser repetida recorrendo a um sistema diferente de fase móvel/fase estacionária. Nas referências 1 e 2 estão descritos os métodos adequados, nomeadamente:

Coluna Zorbaz ODS, 4,6 mm x 25 cm, ou equivalente:

Temperatura: 36ºC;

Fluxo: 1,5 ml/min.;

Fase móvel:

Para a hidroquinona: metanol/água 5/95 (v/v);

Para o éter monometílico de hidroquinona metanol/água 30/70 (v/v);

Para o éter monobenzílico de hidroquinona metanol/água 80/20 (v/v) (ver nota 1).

Coluna Spherisorb S5-ODS ou equivalente:

Fase móvel: água/metanol 90/10 (v/v);

Fluxo: 1,5 ml/min.

Estas condições são adequadas para a hidroquinona (ver nota 2).

(nota 1) M. Herpol-Borremans and M. O. Masse, «Identification et dosage de l'hydroquinone et ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau», Int. J. Cosmet, Sci 8-203-214 (1986).

(nota 2) J. Firth and I. Rix, «Determination of Hydroquinone in skintoning creams», Analyst (1986), 111, p. 129.