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Decreto-Lei n.º 157/98 — Estabelece a disciplina das trocas intracomunitárias de animais das espécies bovina e suína e revoga o Decreto-Lei n.º…

Tipo Decreto-Lei
Publicação 1998-06-09
Última atualização 2011-06-20
Estado Revogada texto desatualizado
Texto Tal como publicado
Ministério Ministério da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas
Fonte DRE
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artigos 23

Este é o ato tal como foi publicado. As alterações posteriores não estão incorporadas no texto: cada uma é um ato autónomo neste repositório e uma entrada no historial desta lei.

3 atos modificativos · 2011-06-20, Decreto-Lei n.º 79/2011 — Estabelece os procedimentos de elaboração de listas e de public…

Estabelece a disciplina das trocas intracomunitárias de animais das espécies bovina e suína e revoga o Decreto-Lei n.º 80/90, de 12 de Março, e as Portarias n.os 467/90, de 22 de Junho, 728/90, de 22 de Agosto, 160/91, de 25 de Fevereiro, 720/91, de 23 de Julho, 463/94, de 30 de Junho, 119/96, de 16 de Abril, e 559/97, de 25 de Julho

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b)

Interpretação das reacções - a interpretação das reacções basear-se-á na observação clínica e no aumento ou aumentos registados na espessura da prega da pele nos pontos de injecção setenta e duas horas depois da injecção da ou das tuberculinas:

ba) Reacção negativa - se apenas se observar um inchaço limitado, com um aumento máximo de 2 mm de espessura da prega da pele, sem sinais clínicos, tais como edema difuso ou extenso, exsudado, necrose, dor ou reacção inflamatória dos canais linfáticos da região ou dos gânglios;

bb) Reacção duvidosa - se não se observar nenhum dos sinais clínicos indicados na alínea ba), mas o aumento de espessura da prega da pele for superior a 2 mm e inferior a 4 mm;

bc) Reacção positiva - se se observarem os sinais clínicos indicados na alínea ba) ou um aumento de espessura da prega da pele de 4 mm ou mais no sítio da injecção.

32 - A interpretação das provas oficiais de tuberculina é a seguinte:

a)

Intradermotuberculinização simples:

Positiva - reacção tal como definida na alínea bc) do n.º 31;

Duvidosa - reacção idêntica à definida na alínea bb) do n.º 31;

Negativa - reacção tal como definida na alínea ba) do n.º 31.

Os animais em que a intradermotuberculinização simples tenha dado resultados duvidosos serão submetidos a uma outra tuberculinização passado um prazo mínimo de 42 dias.

Os animais em que esta segunda prova não dê resultados negativos devem ser considerados como tendo reagido positivamente à prova de tuberculina.

Os animais com resultados positivos na prova intradérmica simples podem ser submetidos a uma intradermotuberculinização de comparação;

b)

Intradermotuberculinização de comparação para a determinação e manutenção do estatuto de efectivo oficialmente indemne de tuberculose:

Positiva - reacção bovina superior em mais de 4 mm à reacção aviária ou presença de sinais clínicos;

Duvidosa - reacção bovina positiva ou duvidosa e superior em 1 mm a 4 mm à reacção aviária e ausência de sinais clínicos;

Negativa - reacção bovina negativa ou reacção bovina positiva ou duvidosa mas igual ou inferior a uma reacção aviária positiva ou duvidosa e ausência de sinais clínicos nos dois casos.

Os animais em que a intradermotuberculinização de comparação tenha dado resultados duvidosos devem ser submetidos a uma outra prova de tuberculina passado um prazo mínimo de 42 dias. Os animais em que esta segunda prova de tuberculina não dê resultados negativos são considerados como tendo reagido positivamente à tuberculina;

c)

O estatuto de efectivo oficialmente indemne de tuberculose pode ser suspenso, ficando os animais do efectivo excluídos do comércio intracomunitário até estar regularizado o estatuto dos animais seguintes:

1) Animais considerados como tendo tido uma reacção duvidosa à prova de tuberculina simples;

2) Animais considerados como tendo reagido positivamente à prova de tuberculina simples mas que devem ser submetidos a uma prova de tuberculina de comparação;

3) Animais considerados como tendo tido uma reacção duvidosa à prova de tuberculina de comparação;

d)

Nos casos em que a legislação comunitária exija que os animais sejam submetidos a uma prova intradérmica antes da sua deslocação, a prova deve ser interpretada de forma que sejam excluídos do comércio intracomunitário os animais em que o aumento de espessura da prega de pele seja superior a 2 mm ou em que se verifique a presença de sinais clínicos.

ANEXO C — Brucelose

A - Provas de seroaglutinação

1 - O soro padrão de aglutinação deve estar em conformidade com o soro padrão preparado pelo Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Inglaterra.

Uma ampola deve conter 1000 UI de aglutinação obtidas por liofilização de 1 ml de soro de bovino.

2 - O soro padrão deve ser o soro fornecido pelo Bundesgesundheitsamt, Berlim.

3 - O grau de aglutinação de brucela no soro deve ser expresso em unidades internacionais (UI) por mililitro (por exemplo, soro x = 80 UI/ml).

4 - As observações referentes à seroaglutinação lenta em tubos devem ser feitas aos 50% ou 75% de aglutinação, tendo o antigénio utilizado sido titulado em idênticas condições por referência a um soro padrão.

5 - O poder aglutinante de vários antigénios em reacção ao soro padrão deve situar-se dentro dos seguintes limites:

  • Se a observação for feita aos 50% - entre 1/600 e 1/1000;
  • Se a observação for feita aos 75% - entre 1/500 e 1/750.

6 - Na preparação do antigénio a utilizar na aglutinação em tubo (método lento) deve ser utilizada a estirpe n.º 99 de Weybridge, a estirpe USDA 1119 ou qualquer outra estirpe de sensibilidade equivalente.

7 - Os meios de cultura utilizados para a conservação da estirpe no laboratório e para a produção de antigénio não devem encorajar a dissociação das bactérias (em s e r); deve utilizar-se, de preferência, o ágar de batata.

8 - A emulsão bacteriana deve ser feita a partir de soro fisiológico (NaCl 8,5%) fenolizado a 5%. Não deve ser utilizado formol.

9 - O Laboratório Nacional de Investigação Veterinária é o organismo público responsável pelas provas oficiais dos antigénios.

10 - Os antigénios podem ser fornecidos concentrados, desde que seja indicado no rótulo do frasco o factor de diluição a utilizar.

11 - Para a realização das provas de seroaglutinação devem ser preparadas, pelo menos, três diluições de cada soro. As diluições do soro suspeito devem ser feitas de forma que a leitura referente à reacção no limite de infecção seja feita no tubo médio. Caso haja uma reacção positiva neste tubo, o soro suspeito contém pelo menos 30 UI de aglutinação por mililitro.

B - Prova da reacção de fixação do complemento

1 - O soro padrão é o mesmo que o mencionado no n.º 1 da parte A do presente anexo. Para além do teor mencionado em unidades internacionais de aglutinação, 1 ml deste soro bovino liofilizado deve conter 1000 unidades de sensibilização que fixem o complemento. Estas unidades de sensibilização são designadas por unidades CEE de sensibilização.

2 - O soro padrão deve ser fornecido pelo Bundesgesundheitsamt, Berlim.

3 - O teor de anticorpos fixadores do complemento no soro deve ser expresso em unidades CEE de sensibilização (por exemplo, soro x = 60 unidades CEE de sensibilização por mililitro).

4 - Um soro que contenha 20 ou mais unidades CEE de sensibilização (por exemplo, uma actividade igual a 20(por mil) da do soro padrão) por mililitro deve ser considerado positivo.

5 - Os soros devem ser inactivados do seguinte modo:

a)

Soro de bovino - 50ºC a 60ºC a durante trinta a cinquenta minutos;

b)

Soro de suíno - 60ºC durante trinta a cinquenta minutos.

6 - Na preparação do antigénio devem ser utilizadas as estirpes n.º 99 de Weybridge ou USDA 1119. O antigénio representa uma suspensão bacteriana em soro fisiológico a 0,85% ou numa solução de carga de Veronal.

7 - Para a realização da prova de reacção dever-se-á utilizar uma dose complementar superior à dose mínima necessária para a hemólise total.

8 - A prova de reacção de fixação do complemento deve ser sempre acompanhada dos seguintes controlos:

a)

Controlo do efeito anticomplementar do soro;

b)

Controlo do antigénio;

c)

Controlo dos corpúsculos vermelhos do sangue sensibilizados;

d)

Controlo do complemento;

e)

Controlo da sensibilidade no início da reacção, utilizando um soro positivo;

f)

Controlo da especificidade da reacção utilizando um soro negativo.

9 - A verificação e o controlo oficial dos soros e antigénios padrão devem ser efectuados pelo Laboratório Nacional de Investigação Veterinária.

10 - Os antigénios podem ser fornecidos concentrados, desde que o factor de diluição a utilizar esteja indicado no rótulo do frasco.

C - Prova do anel

1 - Deve ser submetido à prova do anel o conteúdo de cada batedeira ou de cada cisterna de leite da exploração.

2 - O antigénio padrão a utilizar deve ser proveniente de um instituto comunitariamente definido. Recomenda-se a normalização dos antigénios de acordo com as recomendações da OMS/FAO.

3 - O antigénio só pode ser corado com hematoxilina ou tetrazólio; deve utilizar-se, de preferência, a hematoxilina.

4 - Caso não se tomem medidas de conservação, a prova de reacção deve ser efectuada de dezoito a vinte e quatro horas após a colheita da amostra da vaca. Caso a prova deva ser realizada mais de vinte e quatro horas depois de colhida a amostra de leite, deve utilizar-se um conservante, podendo ser utilizados a formalina ou o cloreto de mercúrio; se for utilizado um destes conservantes, a prova deve ser realizada nos 14 dias seguintes ao da colheita da amostra. A formalina pode ser adicionada ao leite até uma concentração final, na amostra, de 0,2%; nesse caso, a proporção do leite relativamente à solução de formalina deve ser, no mínimo, de 10 para 1. Em vez da formalina, pode ser utilizada uma solução de cloreto de mercúrio, até uma concentração final, no leite, de 0,2%; nesse caso, a relação entre a quantidade de leite e de solução de cloreto de mercúrio deve ser de 10 para 1.

5 - A reacção deve realizar-se segundo um dos seguintes métodos:

  • Numa coluna de leite com, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 1 ml, ao qual se adicionaram 0,03 ml de um dos antigénios corados padronizados;
  • Numa coluna de leite de, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 1 ml, ao qual se adicionaram 0,05 ml de um dos antigénios corados padronizados;
  • Num volume de leite de 8 ml, ao qual se adicionaram 0,08 ml de um dos antigénios corados padronizados;
  • Numa coluna de leite de, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 2 ml, ao qual se adicionaram 0,05 ml de um dos antigénios corados padronizados.

6 - A mistura de leite e antigénios deve ser incubada a 37ºC durante um período não inferior a quarenta e cinco minutos e não superior a sessenta minutos. O ensaio deve ser avaliado nos quinze minutos seguintes à retirada do incubador.

7 - A reacção deve ser avaliada de acordo com os seguintes critérios:

a)

Reacção negativa - leite corado, nata incolor;

b)

Reacção positiva - leite e nata corados da mesma forma, ou leite incolor e nata corada.

D - Prova do antigénio brucélico tamponado

A prova do antigénio brucélico tamponado pode ser realizada por um dos seguintes métodos:

a)

Prova manual:

1) O soro padrão deve ser o segundo soro padrão internacional anti-Brucella abortus fornecido pelo Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Inglaterra;

2) O antigénio deve ser preparado sem referência à concentração de células, devendo a sua sensibilidade ser aferida por comparação com o segundo soro padrão internacional anti-Brucella abortus, de forma que o antigénio produza uma reacção positiva com uma diluição do soro de 1:47,5 e uma reacção negativa com uma diluição de 1:55;

3) Deve preparar-se uma suspensão do antigénio em diluente tamponado de antigénio brucélico com pH de 3,65 (mais ou menos)0,5, e pode ser corado com o corante rosa-de-bengala;

4) Na preparação do antigénio deve ser utilizada a estirpe n.º 99 de Weybridge ou USDA 1119 ou ainda qualquer outra estirpe de sensibilidade equivalente;

5) Os meios de cultura utilizados para a conservação da estirpe no laboratório e para a produção de antigénio não devem encorajar a dissociação das bactérias (em s e r); deve utilizar-se meio ágar de batata ou métodos de cultura contínua;

6) O antigénio deve ser controlado por comparação com oito soros conhecidos liofilizados, positivos e negativos;

7) A verificação oficial e o controlo do antigénio e do soro padrão deve ser efectuada pelo Laboratório Nacional de Investigação Veterinária;

8) O antigénio será fornecido pronto a usar;

9) A prova do antigénio brucélico tamponado será realizada da seguinte forma:

a)

Colocar uma gota (0,03 ml) de antigénio e uma gota (0,03 ml) de soro, numa placa branca;

b)

Misturar as gotas com um agitador, primeiro segundo uma linha recta e depois num movimento circular de cerca de 10 mm a 12 mm de diâmetro;

c)

Depois agitar a placa alternadamente para a frente e para trás durante quatro minutos (cerca de 30 movimentos por minuto);

d)

As leituras devem ser feitas com boa luz; caso não haja sinais de aglutinação, a prova será considerada negativa; qualquer nível de aglutinação será considerado positivo, salvo se tiver havido uma dessecação excessiva na periferia.

b)

Método automatizado - o método automatizado deve ser, pelo menos, tão sensível e preciso como o método manual.

E - Prova do anel em plasma

a)

Extracção do plasma - centrifugar a 3000 r/min, durante três minutos, um tubo contendo sangue ao qual se adicionou EDTA para impedir a coagulação; o tubo deve ser depois mantido a 37ºC e durante doze a vinte e quatro horas.

b)

Avaliação - introduzir 0,2 ml de plasma estabilizado num tubo contendo 1 ml de leite não tratado. Misturar e adicionar depois uma gota (0,05 ml) de antigénio antibrucélico, tornando a misturar em seguida. O antigénio deve ser padronizado por comparação com um antigénio padrão fornecido pelo Bundesgesundheitsamt, Berlim, Alemanha. Incubar durante quarenta e cinco minutos a 37ºC e fazer uma leitura nos quinze minutos seguintes. O resultado será considerado positivo se o anel se tiver tornado da mesma cor que a coluna de leite ou mais escuro.

F - Aglutinação do plasma

O plasma extraído segundo o método previsto na alínea a) da parte E pode ser utilizado imediatamente após a centrifugação, não sendo necessária a estabilização térmica. Misturar 0,05 ml de plasma com 1 ml de antigénio para uma seroaglutinação de 50%, o que corresponde a uma seroaglutinação na diluição de 1:20. A leitura deve ser feita dezoito a vinte e quatro horas após a incubação a 37ºC. Uma aglutinação de 50% ou mais deve ser considerada positiva.

G - Prova de microaglutinação

1 - Os diluentes são constituídos por solução salina fisiológica a 0,85%, com 0,5% de fenol.

2 - O antigénio deve ser preparado de acordo com a parte A, n.os 6, 7 e 8, do presente anexo e ser titulado tal como descrito na parte A, n.º 5. No momento de utilização do antigénio, adicionar safranina O a 0,02% (diluição final).

3 - O soro padrão é o mesmo que o referido na parte A, n.º 1.

4 - O soro padrão deve ser fornecido pelo Bundesgesundheitsamt, Berlim.

5 - A prova de microaglutinação deve ser realizada em placas com cavidades de fundo cónico, com 0,250 ml de volume. A prova deve ser efectuada do seguinte modo:

a)

Pré-diluição do soro - em cada cavidade adicionar 0,050 ml de cada soro a analisar a 0,075 ml de diluente. Agitar as misturas durante trinta segundos;

b)

Diluição gradual do soro - preparar pelo menos três diluições de cada soro. Para tal, a partir das pré-diluições (1:2,5) retirar 0,025 ml de cada soro e colocá-los sobre uma placa que contenha 0,025 ml de diluente. Desta forma, a primeira diluição é de 1 para 5, e as seguintes serão diluídas de um factor 2;

c)

Adição do antigénio - em cada uma das cavidades contendo as diversas diluições do soro adicionar 0,025 ml de antigénio. Agitar as placas durante trinta segundos e em seguida fechá-las com as respectivas tampas e mantê-las a 37ºC e durante vinte a vinte e quatro horas, em atmosfera humidificada;

d)

Leitura dos resultados - a avaliação da sedimentação do antigénio faz-se examinando o fundo da cavidade reflectida num espelho côncavo colocado acima desta. Se a reacção for negativa, o antigénio sedimenta sob a forma de um botão compacto com limite bem definido e de coloração vermelha intensa. Se, pelo contrário, a reacção for positiva, forma-se um véu rosado difuso e uniformemente distribuído. As diversas percentagens de aglutinação são determinadas por comparação com antigénios testemunhas, com 0,25%, 50%, 75% e 100% de aglutinação. O título de cada soro é expresso em unidades internacionais aglutinantes por mililitro. A prova deve incluir testemunhas com soros negativos e positivos, diluídos de forma a conter 30 UI aglutinantes por mililitro.

H - Prova de imunoabsorção enzimática (Elisa) para a pesquisa de brucelose bovina

1 - Os materiais e reagentes a utilizar são os seguintes:

a)

Microplacas para fase sólida, tinas ou qualquer outra fase sólida;

b)

Antigénio fixado à fase sólida com ou sem a ajuda de anticorpos de captação policlonal ou monoclonal;

c)

Fluido biológico a examinar;

d)

Controlos positivos e negativos correspondentes;

e)

Conjugado;

f)

Substrato adaptado ao enzima utilizado;

g)

Solução de paragem, se necessário;

h)

Soluções para a diluição das amostras a ensaiar, para a preparação dos reagentes e para a lavagem;

i)

Sistema de leitura apropriado ao substrato utilizado.

2 - Padronização e sensibilidade da prova:

1) As amostras colectivas de leite examinadas são consideradas negativas se derem uma reacção correspondente a menos de 50% da verificada com uma diluição de 1/10000 do segundo soro padrão internacional de brucelose obtido em leite negativo;

2) As amostras de soro individuais são consideradas negativas se derem uma reacção correspondente a menos de 10% da obtida com uma diluição de 1/200 do segundo soro padrão internacional de brucelose numa solução salina, ou qualquer outra diluição reconhecida, de acordo com o procedimento previsto comunitariamente. Os padrões para a prova Elisa de brucelose serão os especificados na parte A, n.os 1 e 2, do presente anexo (a utilizar nas diluições indicadas no rótulo).

3 - Condições de utilização da prova Elisa para a pesquisa da brucelose bovina - o método Elisa pode ser utilizado numa amostra de leite ou soro retirada de uma colheita de leite proveniente de uma exploração com, pelo menos, 30% de vacas leiteiras em lactação.

Se se utilizar este método, devem ser tomadas medidas que garantam a possibilidade de identificar, a partir da amostra, os animais de que provêm o leite ou os soros examinados.

ANEXO D — CAPÍTULO I

Efectivos, Estados membros e regiões oficialmente indemnes de leucose bovina enzoótica

A - Um efectivo é considerado oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica se:

i)

Não existirem provas, quer clínicas quer laboratoriais, de qualquer caso de leucose bovina enzoótica no efectivo nem tiver sido confirmado qualquer caso nos dois anos anteriores; e

ii) Todos os animais com idade superior a 24 meses tiverem sido submetidos, com reacções negativas, a duas provas realizadas nos 12 meses precedentes, em conformidade com o presente anexo, com um intervalo de, pelo menos, quatro meses; ou

iii) Preencher as condições da alínea i) anterior e estiver situado numa região oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica.

B - Um efectivo manterá o estatuto de oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica se:

i)

Continuar a estar preenchida a condição da alínea i) da parte A;

ii) Todos os animais introduzidos no efectivo forem provenientes de um efectivo oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica;

iii) Todos os animais com idade superior a 24 meses continuarem a apresentar reacção negativa a provas realizadas de três em três anos de acordo com o capítulo II.

C - O estatuto de efectivo oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica será suspenso caso deixem de estar preenchidas as condições especificadas na parte B anterior.

D - O estatuto permanecerá suspenso até que estejam preenchidas as seguintes condições:

1) Se, num efectivo oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica, apenas um animal tiver apresentado reacção positiva a uma das provas referidas no capítulo II:

i)

O animal que reagiu positivamente e, no caso de uma vaca, todos os vitelos seus descendentes, devem ter sido retirados do efectivo e enviados para o matadouro, sob o controlo das autoridades veterinárias;

ii) Os restantes animais devem ter apresentado reacção negativa a provas sorológicas realizadas de acordo com o capítulo II, pelo menos três meses após a retirada dos animais positivos e dos seus eventuais descendentes;

iii) Deve ser realizado um inquérito epidemiológico, e os efectivos epidemiologicamente ligados ao efectivo infectado devem ser submetidos às medidas referidas na alínea ii).

A autoridade competente pode, no entanto, conceder uma derrogação da obrigação de abate do vitelo de uma vaca infectada, desde que este tenha sido separado da mãe após o parto. Neste caso, o vitelo deve ser submetido às condições previstas na alínea iii) do n.º 2);

2) Caso mais de um animal do efectivo oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica tenha apresentado reacção positiva ou caso tenha sido confirmada a infecção no efectivo:

i)

Os animais que apresentaram uma reacção positiva e os respectivos vitelos, se se tratar de vacas, devem ser retirados para abate sob controlo das autoridades veterinárias;

ii) Todos os animais com idade superior a 24 meses devem ter sido submetidos, com reacção negativa, a duas provas realizadas de acordo com o capítulo II, com um intervalo mínimo de 4 e máximo de 12 meses;

iii) Todos os restantes animais devem, depois de identificados, permanecer no efectivo até terem idade superior a 24 meses e terem sido submetidos, com resultados satisfatórios, às provas referidas na alínea ii);

iv) Deve ser realizado um inquérito epidemiológico, devendo o efectivo epidemiologicamente ligado ao efectivo infectado ser submetido às medidas estabelecidas na alínea ii).

A autoridade competente pode, no entanto, conceder uma derrogação da obrigação de abate do vitelo de uma vaca infectada, desde que este tenha sido separado da mãe após o parto. Neste caso, o vitelo deve ser submetido às condições previstas na alínea iii);

3) Caso o estatuto de efectivo indemne de leucose bovina enzoótica tenha sido suspenso por qualquer outra razão, todos os animais do efectivo com idade superior a 24 meses devem apresentar reacção negativa a uma prova sorológica realizada de acordo com o capítulo II.

E - De acordo com o procedimento comunitariamente previsto pode ser proposta a concessão do estatuto de indemne de leucose bovina enzoótica ao território nacional ou região, se:

a)

Pelo menos 99,8% do efectivo bovino estiverem indemnes de leucose bovina enzoótica, na acepção da parte A; ou

b)

Não tiver sido confirmado qualquer caso de leucose bovina enzoótica no território nacional ou região, durante os últimos três anos, e, no caso da totalidade do território nacional, todos os animais com idade superior a 24 meses, de pelo menos 10% dos efectivos seleccionados ao acaso, tiverem sido submetidos, com resultados negativos, a uma prova nos termos do capítulo II nos 24 meses anteriores ou, no caso de uma região ou do território nacional, todos os animais com idade superior a 24 meses tiverem sido submetidos, com resultados negativos, a uma prova prevista no capítulo II.

F - O território nacional ou uma região manterão o estatuto de oficialmente indemnes de leucose bovina enzoótica se:

i)

Se verificar anualmente, com base numa amostra ao acaso correspondente a um nível de confiança de 99%, que menos de 0,2% dos efectivos estão infectados, ou que pelo menos 20% dos bovinos com idade superior a 2 anos foram submetidos, com resultados negativos, a uma prova realizada de acordo com o capítulo II; ou

ii) Se não se tiver registado nenhum caso de leucose bovina enzoótica no território nacional ou região, numa proporção de 1 efectivo para 10000, durante pelo menos três anos; nesse caso, pode ser tornada, de acordo com o comunitariamente previsto, a decisão de interromper a pesquisa sorológica sistemática, desde que:

Todos os bovinos abatidos no território nacional ou região sejam submetidos a um exame post mortem por um veterinário oficial, que deverá notificar todos os tumores com vista a um exame laboratorial; e

Seja relatada a ocorrência de todos os casos de leucose bovina enzoótica na região afectada. De acordo com o procedimento comunitariamente previsto, pode ser proposta a suspensão ou revogação da decisão de interromper a pesquisa sorológica sistemática; e

Todos os bovinos com reacção positiva a uma prova de imunodifusão sejam abatidos, devendo o efectivo permanecer submetido a restrições até ao restabelecimento do seu estatuto nos termos do capítulo I, parte D, do presente anexo.

G - i) O estatuto de uma região oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica será suspenso, de acordo com o procedimento previsto comunitariamente, caso seja detectada e confirmada a presença de leucose bovina enzoótica em mais de 0,2% das explorações dessa região.

ii) O estatuto de oficialmente indemne de leucose bovina enzoótica pode ser restabelecido de acordo com o procedimento previsto comunitariamente, se:

a)

Para além das medidas previstas nos n.os 1 e 2 da parte D, pelo menos 20% dos outros efectivos seleccionados ao acaso na região ou no território nacional tiverem sido submetidos, dentro de um prazo de 12 meses, a uma das provas referidas no capítulo II;

b)

Os resultados destas provas indicarem, com um nível de confiança de 99%, que menos de 0,2% dos efectivos estão infectados.

CAPÍTULO II — Provas para pesquisa de leucose bovina enzoótica

A pesquisa de leucose bovina enzoótica efectua-se mediante a prova de imunodifusão nas condições descritas nas partes A e B, ou mediante a prova de imunoabsorção enzimática (Elisa) nas condições descritas na parte C. O método de imunodifusão só se aplica às provas individuais. No caso de os resultados das provas serem objecto de uma contestação devidamente fundamentada, efectuar-se-á uma prova de imunodifusão como controlo complementar.

A - Provas de imunodifusão sobre placas de ágar para pesquisa de leucose bovina enzoótica:

1 - O antigénio a utilizar nesta prova deve conter glicoproteínas do vírus da leucose bovina. O antigénio deve ser padronizado em relação a um soro padrão (soro E1) fornecido pelo Statens Veterinaere Serumlaboratorium de Copenhaga.

2 - O organismo público encarregue de calibrar o antigénio padrão de trabalho no laboratório por comparação com o soro padrão oficial CEE (soro E1) fornecido pelo Statens Veterinaere Serumlaboratorium de Copenhaga é o Laboratório Nacional de Investigação Veterinária.

3 - Os antigénios padrão utilizados no laboratório devem ser apresentados pelo menos uma vez por ano aos laboratórios de referência CEE enumerados no n.º 2, para aí serem testados por comparação com o soro padrão CEE. Independentemente desta padronização, o antigénio utilizado pode ser calibrado nos termos da parte B.

4 - Na prova serão utilizados os reagentes seguintes:

a)

Antigénio: o antigénio deve conter glicoproteínas específicas do vírus da leucose bovina enzoótica padronizado por comparação com o soro padrão oficial CEE;

b)

O soro a testar;

c)

Um soro de controlo positivo conhecido;

d)

Ágar:

0,8% ágar;

8,5% NaCl;

Tampão Tris 0,05 M, pH 7,2;

devem colocar-se 15 ml deste ágar numa placa de Petri de 85 mm de diâmetro, o que dá uma altura de 2,6 mm de ágar.

5 - Preparar um dispositivo experimental de sete cavidades isentas de humidade por perfuração do ágar até ao fundo da placa; a rede assim obtida deverá ser constituída por uma cavidade central em torno da qual se ordenam seis cavidades periféricas dispostas em círculo.

Diâmetro da cavidade central: 4 mm;

Diâmetro das cavidades periféricas: 6 mm;

Distância entre a cavidade central e as cavidades periféricas: 3 mm.

6 - Encher a cavidade central com o antigénio padrão. As cavidades periféricas 1 e 4 (ver esquema abaixo) são enchidas com o soro positivo conhecido e as cavidades 2, 3, 5 e 6 com os soros a testar. As cavidades devem ser enchidas até ao desaparecimento do menisco.

7 - As quantidades obtidas são as seguintes:

Antigénio: 32 (mi)l;

Soro de controlo: 73 (mi)l;

Soro a testar: 73 (mi)l.

8 - A incubação deve durar setenta e duas horas à temperatura ambiente (20ºC-27ºC) em atmosfera húmida e fechada.

9 - A prova pode ser lida passadas vinte e quatro horas e passadas quarenta e oito horas, mas não se pode obter qualquer resultado final antes de passarem setenta e duas horas.

a)

Um soro a testar é positivo se formar uma curva de precipitação específica com o antigénio do vírus da leucose bovina e se essa curva coincidir com a do soro de controlo.

b)

Um soro a testar é negativo se não formar uma curva de precipitação específica com o antigénio do vírus da leucose bovina e se não inflectir a curva do soro de controlo.

c)

A reacção não pode ser considerada concludente se:

i)

Inflectir a curva do soro de controlo para a cavidade do antigénio do vírus da leucose bovina sem formar uma curva de precipitação visível com o antigénio; ou

ii) Não for possível interpretá-la como negativa ou como positiva.

No caso de as reacções não serem concludentes, pode repetir-se a prova e utilizar soro concentrado.

10 - Pode ser utilizada qualquer outra configuração ou distribuição das cavidades, desde que permita detectar como positiva uma diluição do soro E4 em soro negativo a 1:10.

B - Método de padronização do antigénio. - Soluções e materiais necessários:

1) 40 ml de ágar a 1,6% num tampão Tris 0,05 M/HCIl, pH 7,2, com 8,5% de NACl;

2) 15 ml de um soro de leucose bovina que só tenha anticorpos em relação às glicoproteínas do vírus da leucose bovina, diluído a 1:10 num tampão Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2, com 8,5% de NaCl;

3) 15 ml de um soro de leucose bovina que só tenha anticorpos em relação às glicoproteínas do vírus da leucose bovina, diluído a 1:15 num tampão Tris 0,05 M/HCl, pH 7,2, com 8,5% de NaCl;

4) Quatro placas de Petri de plástico, com 85 mm de diâmetro;

5) Punção com 4 mm a 6 mm de diâmetro;

6) Antigénio de referência;

7) Antigénio a padronizar;

8) Banho-maria (56ºC).

Modo de execução:

Dissolver o ágar (1,6%) no tampão Tris/HCl, aquecendo com cuidado até 100ºC. Pôr no banho-maria a 56ºC durante cerca de uma hora. Colocar também as diluições do soro de leucose bovina no banho-maria a 56ºC.

Misturar em seguida 15 ml de solução de agarose a 56ºC com os 15 ml de soro de leucose bovina (1:10), agitar rapidamente e deitar em duas placas de Petri, à razão de 15 ml por placa.

Repetir as operações atrás descritas com o soro de leucose bovina diluído a 1:5.

Quando a agarose tiver endurecido, fazer as cavidades do seguinte modo:

Adição de antigénio:

i)

Placas de Petri n.os 1 e 3:

Cavidade A - antigénio de referência não diluído;

Cavidade B - antigénio de referência diluído a 1:2;

Cavidades C e E - antigénio de referência;

Cavidade D - antigénio a testar, não diluído;

ii) Placas de Petri n.os 2 e 4:

Cavidade A - antigénio a testar, não diluído;

Cavidade B - antigénio a testar, diluído a 1:2;

Cavidade C - antigénio a testar, diluído a 1:4;

Cavidade D - antigénio a testar, diluído a 1:8.

Instruções complementares:

1 - A prova deve ser efectuada com dois graus de diluição do soro (1:5 e 1:10) a fim de obter a precipitação óptima.

2 - Se o diâmetro de precipitação for muito pequeno para cada um dos dois graus de diluição, deve fazer-se uma diluição suplementar do soro.

3 - Se o diâmetro de precipitação for excessivo para ambos os graus de diluição e se o precipitado for ténue, deve-se escolher um grau de diluição mais fraco para o soro.

4 - A concentração final de ágar deve ser de 0,8% e a dos soros de 5% e de 10%, respectivamente.

5 - Anotar os diâmetros medidos no gráfico seguinte. A diluição de trabalho é aquela em que se registar o mesmo diâmetro para o antigénio a testar e para o antigénio de referência.

C - Prova de imunoabsorção enzimática (Elisa) para a pesquisa de leucose bovina enzoótica:

1 - São os seguintes os materiais e reagentes a utilizar:

a)

Microplacas para fase sólida, tinas ou qualquer outra fase sólida;

b)

Antigénio fixado à fase sólida com ou sem a ajuda de anticorpos de captação policlonal ou monoclonal. No caso da LBE, se o antigénio for directamente aplicado à fase sólida, todas as amostras que apresentem reacções positivas devem ser testadas de novo em relação ao antigénio de controlo. Este deve ser idêntico ao antigénio testado, excepto no que respeita aos antigénios BLV. Se os anticorpos de captação forem aplicados à fase sólida, os anticorpos devem reagir apenas aos antigénios BLV;

c)

Fluido biológico a examinar;

d)

Controlos positivos e negativos correspondentes;

e)

Conjugado;

f)

Substrato adaptado ao enzima utilizado;

g)

Solução de paragem, se necessário;

h)

Soluções para a diluição das amostras de ensaio, para a preparação dos reagentes e para a lavagem;

i)

Sistema de leitura adequado ao substrato utilizado.

2 - Normalização e sensibilidade do teste. - A sensibilidade da prova Elisa utilizada deve ser de um nível tal que o soro E4 seja positivo quando diluído 10 vezes (amostras de soro) ou 250 vezes (amostras de leite) em mais de uma solução obtida a partir de amostras colocadas em conjunto. Em provas em que as amostras (soro e leite) sejam examinadas individualmente, o soro E4, diluído à razão de 1:10 (para o soro negativo) ou à razão de 1:250 (para o leite negativo), deve dar uma reacção positiva quando for examinado na mesma diluição que é utilizada para os ensaios individuais. Os organismos públicos indicados no n.º 2 da parte A serão responsáveis pelo controlo da qualidade do método Elisa, nomeadamente para determinar, para cada lote de produção, o número de amostras a reunir, com base na contagem obtida com o soro E4.

O soro E4 é fornecido pelo Statens Veterinaere Serumlaboratorium de Copenhaga.

3 - Condições de utilização do teste Elisa para a pesquisa de leucose bovina enzoótica. - O método Elisa pode ser utilizado numa amostra de leite ou soro retirada de uma colheita de leite proveniente de uma exploração com pelo menos 30% das vacas leiteiras em lactação.

Se for utilizado este método, devem ser tomadas medidas que garantam a correspondência entre as amostras recolhidas e os animais de que provêm o leite ou os soros analisados.

ANEXO E (I)

a)

Doenças dos bovinos:

Febre aftosa.

Raiva.

Tuberculose.

Brucelose.

Peripneumonia contagiosa dos bovinos.

Leucose bovina enzoótica.

Carbúnculo bacterídeo.

b)

Doenças dos suínos:

Raiva.

Brucelose.

Peste suína clássica.

Peste suína africana.

Febre aftosa.

Doença vesiculosa do suíno.

Carbúnculo bacterídeo.

ANEXO E (II)

Doença de Aujeszky.

Rinotraqueíte infecciosa dos bovinos.

Infecção por Brucella suis.

Gastrenterite transmissível.

ANEXO F — Espécies bovina/suína de abate/de reprodução/de produção (ver nota 1)

Certificado n.: ...

Espécie: ...

Estado membro de origem: ...

Região de ...

Origem: ...

SECÇÃO A

Nome e endereço do exportador: ...

Nome e endereço da exploração de origem: ... (ver nota 2)

Número de registo do comerciante: ... (ver nota 1)

Informações sanitárias:

Certifico que os animais adiante enumerados são originários de um efectivo ou de efectivos oficialmente indemnes de tuberculose, brucelose e leucose e que (ver nota 3):

O efectivo de origem se encontra num Estado membro ou numa parte do território de um Estado membro que é reconhecido como ou:

1) Oficialmente indemne de tuberculose: sim/não.

Decisão .../.../... da Comissão (ver nota 1);

2) Oficialmente indemne de brucelose: sim/não.

Decisão .../.../... da Comissão (ver nota 1);

3) Oficialmente indemne de leucose: sim/não.

Decisão .../.../... da Comissão (ver nota 1).

O Estado membro ou parte do território de um Estado membro aplica um sistema de redes de vigilância:

Decisão .../.../... da Comissão (ver nota 1).

Os animais adiante enumerados foram sujeitos às seguintes provas, com resultados negativos nos 30 dias que precederam a saída da exploração nos termos do n.º 2 do artigo 6.º do anexo A do regulamento anexo ao Decreto-Lei n.º .../..., de ... de ..., do seguinte modo:

Data da prova: ...

Prova de tuberculina (animais com mais de 6 semanas): sim/não.

Exigida ... (ver nota 1).

Prova de seroaglutinação brucélica (com exclusão dos animais castrados ou com menos de 12 meses): sim/não.

Exigida ... (ver nota 1).

Prova para pesquisa da leucose (animais com mais de 12 meses): sim/não.

Exigida ... (ver nota 1).

São animais para abate (ver nota 1).

São animais para abate originários de efectivos não oficialmente indemnes de tuberculose, brucelose e leucose e provêm de uma exploração situada em Espanha (ver nota 1) (ver nota 4); os animais adiante enumerados foram sujeitos a provas, com resultados negativos, nos 30 dias que precederam a saída da exploração de origem, do seguinte modo:

Data da prova: ...

Prova de tuberculina: ... (ver nota 1).

Prova de seroaglutinação brucélica: ... (ver nota 1).

Prova para pesquisa da leucose: ... (ver nota 1).

SECÇÃO B

Identificação do animal: ...

Número total de animais: ...

Raça: ...

Tipo: ...

Idade: ...

Identificação oficial: ...

Data de partida: ...

Certificação relativa às secções A e B

(Carimbo oficial.)

Assinatura do veterinário oficial da exploração de origem ou, no caso de um Estado membro que tenha criado um sistema de rede de vigilância, assinatura do veterinário autorizado da exploração de origem (ver nota 1): ...

Nome (em maiúsculas): ...

Data: ...

SECÇÃO C

Centro de agrupamento autorizado (ver nota 1):

Nome do centro: ...

Endereço: ...

Número de registo: ...

Data de chegada: ...

Data de partida: ...

Assinatura/carimbo: ...

SECÇÃO D

Destino dos animais: ...

Nome e endereço do exportador: ...

Nome e endereço da exploração de destino: ... (ver nota 1).

Nome e endereço do centro de trânsito: ... (ver nota 1).

Meio de transporte: ...

Número de autorização: ...

Após verificação regulamentar, certifico que:

1 - Em ... (data) os animais em causa foram inspeccionados, nas vinte e quatro horas que precederam a partida, e não revelaram quaisquer indícios clínicos de doença infecciosa ou contagiosa.

2 - Se encontram satisfeitas todas as disposições aplicáveis do regulamento anexo ao Decreto-Lei n.º .../..., de ... de ...

3 - O transporte proposto foi registado no sistema ANIMO no dia da expedição.

4 - O animal/os animais a seguir indicado(s) satisfaz(em) as garantias suplementares relativas à ... (doença) dos ... (espécie/tipo) com destino a ... (Decisão .../.../.../CE da Comissão).

(Carimbo oficial.)

Assinatura do veterinário oficial: ...

Nome (maiúsculas): ...

Título: ...

Endereço: ...

O presente certificado é válido durante 10 dias a contar da data do exame sanitário referido na secção D acima.

(nota 1) Riscar as menções inúteis.

(nota 2) Não se aplica quando os animais são originários de várias explorações.

(nota 3) Não se aplica em caso de derrogação concedida a Espanha para animais para abate.

(nota 4) Sujeito ao acordo do país de destino.

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