Decreto-Lei n.º 222/2001 — Altera o Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de…

Para a preparação dos discos de pele são utilizados ratos jovens (20-23 dias) (Wistar ou estirpe comparável). Os pelos dorsais e dos flancos são removidos cuidadosamente, com a ajuda de pequenas tesouras. Os animais são depois cuidadosamente lavados e esfregados, devendo a zona da pele que irá ser utilizada ser mergulhada numa solução antibiótica (contendo, por exemplo, estreptomicina, penicilina, cloranfenicol e anfoteriicina a concentrações suficientes para inibir o crescimento bacteriano). Os animais são novamente lavados com uma solução antibiótica no terceiro ou no quarto dia após a primeira lavagem, devendo depois ser utilizados num prazo de três dias (para a preparação das peles não deverão ser utilizados animais com uma idade superior a 31 dias).

1.5.2 Preparação dos discos de pele

Os animais são sacrificados sem crueldade. A pele dorsal dos animais é depois retirada e a gordura em excesso é removida através de raspagem cuidadosa. A pele é colocada sobre a extremidade de um tubo de politetrafluoroetileno/(PTFE), com o cuidado de garantir que a superfície epidérmica esteja em contacto com o tubo. A pele é fixa na extremidade do tubo com uma junta tónica em borracha e elimina-se o tecido em excesso. As dimensões do tubo e da junta tónica são as apresentadas na figura 1. A junta tónica deve ser envolvida em vaselina, de forma a garantir a estanquecidade da sua união com o tubo de PTFE. O tubo é depois suspenso por uma mola dentro de uma câmara com uma solução de sulfato de magnésio (154 mM) (figura 2).

1.5.3 Procedimento de ensaio

1.5.3.1 Aplicação do material de ensaio

As substâncias de ensaio líquidas (150 (mi)l) são aplicadas na superfície epidérmica no interior do tubo (figura 2). Quando a substância de ensaio for sólida, deverá ser aplicada uma quantidade suficiente para garantir a cobertura de toda a superfície epidérmica. Por cima dessa substância é depois acrescentada água desionizada (150 (mi)l) e os tubos são ligeiramente agitados. As substâncias de ensaio deverão estar em contacto com toda a superfície da pele. No caso de algumas substâncias sólidas, poderá ser necessário aquecer a mistura a 30ºC para fluidificar a substância ou ainda proceder a uma moagem para obtenção de um material granular ou pulverulento.

Para cada substância de ensaio serão utilizados três discos de pele. As substâncias de ensaio são aplicadas durante um período de 24 horas (v. também o ponto 1.5.3.4). A substância de ensaio deverá depois ser removida por lavagem em água corrente a uma temperatura máxima de 30ºC até à remoção completa de todo o material. A remoção das substâncias de ensaio que tenham eventualmente solidificado poderá ser facilitada utilizando um jacto de água a uma temperatura de cerca de 30ºC.

1.5.3.2 Medições TER

A TER é medida utilizando um databridge de corrente alterna de baixa voltagem (por exemplo: AIM 401 ou 6401, ou outro modelo equivalente). Antes da medição da resistência eléctrica, a tensão superficial da pele é reduzida através da adição de um volume suficiente de etanol a 70% para cobrir toda a epiderme. Após alguns segundos, o etanol deverá ser removido invertendo o tubo e o tecido é depois hidratado através da adição de 3 ml de solução de sulfato de magnésio (154 mM). Os eléctrodos do databridge são colocados em duas extremidades do disco de pele de forma a medir a resistência em k(Ómega)/disco (figura 2). As dimensões dos eléctrodos e o comprimento de eléctrodo que deverá ficar livre por baixo da mola são indicados na figura 1. A parte interior (mais grossa) do eléctrodo deverá estar apoiada à borda do tubo de PTFE durante a medição da resistência, de forma a garantir que o comprimento de eléctrodo mergulhado na solução de sulfato de magnésio seja constante. O eléctrodo exterior (mais fino) deverá ser colocado dentro da câmara receptora de forma a tocar o fundo da mesma. A distância entre a parte inferior da mola e o fundo do tubo de PTFE deverá ser mantida constante (figura 1), visto que afecta o valor de resistência medido.

De notar que nos casos em que seja medida uma resistência superior a 20 k(Ómega), isso se poderá dever ao facto de a substância de ensaio estar a impedir o acesso da solução ao disco de epiderme. Para resolver esse problema, uma das possibilidades será tapar o tubo de PTFE com o dedo, usando luvas de borracha, e agitar durante cerca de 10 segundos. A solução de sulfato de magnésio deverá então ser deitada fora e substituída por solução fresca para a realização da medição.

A média dos valores de TER medidos poderá ser aceite, desde que os valores medidos em amostras de controlo positivo e negativo simultâneas com o ensaio se encontrem dentro dos valores normais para o método. As substâncias de controlo que poderão ser utilizadas e os respectivos valores aceitáveis para a metodologia e instrumentos aqui descritos são:

(ver quadro no documento original)

1.5.3.3 Procedimento alterado para as substâncias tensoactivas e para as substâncias orgânicas neutras

Se os valores de TER das substâncias de ensaio que sejam tensoactivas ou que sejam substâncias orgânicas neutras forem inferiores ou iguais a 5 k(Ómega), poderá proceder-se a uma avaliação da penetração de corantes nos tecidos. Esse procedimento permitirá determinar se os resultados são ou não falsos positivos (ver nota 2).

1.5.3.3.1 Aplicação e eliminação do corante sulforhodamina B

Após o tratamento inicial com a substância de ensaio, aplicam-se à superfície epidérmica de cada disco de pele 150 (mi)l de uma solução a 10% (p/v) do corante sulforhodamina B em água destilada, durante 2 horas. Os discos são depois lavados em água corrente à temperatura ambiente durante cerca de 10 segundos, a fim de remover o corante em excesso/não fixado. Os discos de pele deverão então ser cuidadosamente retirados do tubo de PTFE e colocados num recipiente (por expemplo: um frasco de 20 ml) com água desmineralizada (8 ml). Os frascos são cuidadosamente agitados durante 5 minutos, para remover o corante que eventualmente ainda exista em excesso/não fixado. Esse procedimento de lavagem deverá depois ser repetido, após o que os discos de pele deverão ser transferidos para frascos com 5 ml de uma solução a 30% (p/v) de dodecil sulfato de sódio (SDS) em água destilada e incubados a 60ºC de um dia para o outro. Após a incubação, os discos de pele são retirados e deitados fora, e a solução centrifugada durante 8 minutos a 21ºC (força relativa de centrifugação: ~ 175). Uma amostra de 1 ml do sobrenadante será então diluída num factor de 1:5 (v/v) [ou seja, 1 ml + 4 ml] numa solução a 30% (p/v) de SDS em água destilada. A densidade óptica (DO) da solução deverá então ser medida a cerca de 565 nm.

1.5.3.3.2 Cálculo do teor em corante

O teor do corante sulforhodamina B por disco é calculado a partir dos valores de DO (coeficiente de extinção molar do corante sulforhodamina B a 565 nm = 8,7 x 10(elevado a 4); peso molecular = 580). O teor deverá ser determinado para cada disco de pele e também em termos de valor médio dos replicados. Poderão ser aceitáveis valores médios para a ligação do corante, desde que os valores medidos nos controlos se encontrem dentro das gamas normais para o método. As gamas de concentração do corante que poderão ser utilizadas nas substâncias de controlo para a metodologia e instrumentos aqui descritos são:

(ver quadro no documento original)

1.5.3.4 Informação adicional

As substâncias de ensaio também poderão ser aplicadas por períodos de tempo menores (por exemplo, 2 horas), para identificação dos materiais mais severamente corrosivos. Contudo, no estudo de validação, verificou-se que o ensaio TER resulta na sobrestimação do potencial corrosivo de diversos materiais de ensaio quando se utiliza uma aplicação de apenas 2 horas (ver nota 2), embora permita uma identificação correcta das substâncias corrosivas e não corrosivas após uma aplicação ao longo de 24 horas.

As propriedades e dimensões do aparelho a utilizar nos ensaios e o procedimento experimental aplicado podem influenciar os valores de TER obtidos. O limiar de corrosão de 5 k(Ómega) foi desenvolvido a partir dos dados obtidos com o aparelho e com os procedimentos descritos no presente método. Poderão ser aplicáveis outros limiares e valores de controlo se as condições do ensaio forem significativamente diferentes. Logo, recomenda-se que a metodologia e os valores para o limiar de resistência sejam calibrados através do ensaio de uma série de materiais de referência a seleccionar de entre os materiais utilizados no estudo de validação (ver nota 3).

1.6 Princípio do método de ensaio - Ensaio em modelo de pele humana

O material de ensaio é aplicado localmente por um período que poderá ir até 4 horas num modelo tridimensional de pele humana, que inclui uma epiderme reconstruída com um stratum corneum funcional. Os materiais corrosivos são identificados pela sua capacidade de diminuição da viabilidade celular (que poderá ser determinada, por exemplo, utilizando o ensaio de redução MTT) abaixo de determinados limiares em função dos períodos de exposição utilizados. O princípio do ensaio baseia-se na hipótese de que as substâncias químicas corrosivas são as que conseguem penetrar o stratum corneum (por difusão ou por erosão) e que são suficientemente citotóxicas para causar morte celular nas camadas celulares subjacentes.

1.7 Descrição do método de ensaio - Ensaio em modelo de pele humana

1.7.1 Modelo de pele humana

Os modelos de pele humana podem ter diversas origens, mas devem sempre cumprir determinados critérios. Assim, o modelo deverá ter um stratum corneum funcional e uma camada subjacente de células vivas. O stratum corneum deverá ter uma função de barreira adequada. Essa característica poderá ser comprovada através da demonstração da resistência do modelo à citotoxicidade após aplicação de substâncias comprovadamente citotóxicas mas que normalmente não conseguem atravessar o stratum corneum. Para além disso, deverá demonstrar-se que o modelo permite obter resultados reprodutíveis em determinadas condições experimentais.

A viabilidade celular das células vivas do modelo deverá ser suficiente para permitir distinguir bem os resultados das substâncias de controlo positivo e negativo. A viabilidade celular (medida, por exemplo, pela redução do MTT, ou seja, por um valor de DO) após a exposição à substância de controlo negativo deverá manter-se em níveis aceitáveis para o modelo de pele específico que esteja a ser utilizado. Da mesma forma, os valores da viabilidade celular após exposição à substância de controlo positivo (por comparação com a viabilidade do controlo negativo) deverá também situar-se dentro de determinados limites. Mais importante ainda, o modelo preditivo utilizado deverá ter sido certificado de acordo com normas de validação internacionais (ver nota 2).

1.7.2 Procedimento de ensaio

1.7.2.1 Aplicação do material de ensaio

Para os materiais líquidos deverá ser aplicada uma quantidade suficiente para cobrir toda a superfície de pele (no mínimo 25 (mi)l/cm2). Para os materiais sólidos deverá ser também aplicada uma quantidade suficiente para cobrir toda a pele e humidificada por forma a garantir um bom contacto com a pele: quando necessário, os sólidos poderão ser moídos antes da aplicação. Deverá ser demonstrado que o método de aplicação utilizado é adequado para diversos tipos químicos (ver nota 2). Após o período de exposição, o material de ensaio deverá ser cuidadosamente lavado da superfície da pele com uma solução salina.

1.7.2.2 Medição da viabilidade celular

A viabilidade celular poderá ser medida através de qualquer método quantitativo devidamente validado. O ensaio utilizado mais frequentemente é a redução do MTT, que permite comprovadamente obter resultados fiáveis e reprodutíveis entre laboratórios (ver nota 2). O disco de pele é colocado numa solução MTT a 0,3 mg/ml, a 20ºC-28ºC durante 3 horas. O precipitado azul de formazan é depois extraído (extracção com solvente) e a sua concentração é medida através da determinação da DO a um comprimento de onda entre 545 nm e 595 nm.

1.7.2.3 Outras informações

O modelo de pele utilizado, tal como o protocolo exacto para o tempo de exposição, os procedimentos de lavagem, etc., terão um impacte significativo sobre os resultados em termos de viabilidade celular. Recomenda-se que a metodologia e o modelo preditivo sejam calibrados através do ensaio de uma série de padrões a escolher de entre os produtos químicos utilizados no estudo de validação do ECVAM (ver nota 3). Um dos factores críticos será a demonstração da reprodutibilidade do método utilizado infra e interlaboratórios para diversos produtos químicos, de acordo com as normas internacionais. O método deverá cumprir, no mínimo, os critérios de validade científica já definidos (ver nota 2) e os resultados dos estudos de validação devem ser publicados em revista científica dedicada a estudos comparativos.

2 Dados

2.1 Tratamento dos resultados

2.1.1 Ensaio TER em pele de rato

Os valores de resistência (k(Ómega)) do material de ensaio, dos controlos positivo e negativo e de qualquer produto químico padrão utilizado deverão ser apresentados sob a forma de uma tabela, incluindo todos os dados relativos aos replicados/repetição de experiências, os valores médios e as classificações daí deduzidas em termos de corrosividade.

2.1.2 Ensaio em modelo de pele humana

Os valores da DO e os dados relativos aos cálculos da percentagem de viabilidade celular do material de ensaio, dos controlos positivo e negativo e de qualquer produto químico padrão utilizado deverão ser apresentados sob a forma de uma tabela, incluindo todos os dados relativos aos replicados/repetição de experiências, os valores médios e as classificações daí deduzidas em termos de corrosividade.

2.2 Avaliação e interpretação dos resultados

2.2.1 Ensaio TER em pele de rato

Caso o valor médio de TER obtido para a substância de ensaio seja superior a 5 k(Ómega), a substância é considerada não corrosiva. Se o valor do TER for inferior a ou igual a 5 k(Ómega) e se a substância em causa não for tensoactiva nem um composto orgânico neutro, será considerada corrosiva.

Se a substância for tensoactiva ou um composto orgânico neutro e se o valor de TER for inferior ou igual a 5 k(Ómega), poderá proceder-se a um tratamento com corante. Se o teor médio de corante dos discos for superior ou igual ao teor médio de corante dos discos de controlo positivo com HCl a 36% testados em simultâneo, o resultado da substância de ensaio é um positivo verdadeiro e portanto a substância deve ser considerada corrosiva. Se o teor médio de corante dos discos for inferior ao teor médio de corante dos discos de controlo positivo com HCl a 36% testados em simultâneo, o resultado da substância de ensaio é um falso positivo e portanto a substância deve ser considerada como não corrosiva.

2.2.2 Ensaio em modelo de pele humana

O valor de DO do controlo negativo representa 100% de viabilidade celular, pelo que os valores obtidos para cada amostra de ensaio poderão ser utilizados para calcular uma percentagem de viabilidade relativa em relação ao controlo negativo. A percentagem que deverá ser considerada para separar os materiais de ensaio corrosivos dos não corrosivos (ou para distinguir entre as diferentes classes de corrosividade) deverão ser claramente definidos no modelo preditivo durante a validação do método, e deve ser demonstrado, no quadro do estudo de validação, que esse valor é apropriado (ver nota 2).

3 Apresentação dos resultados

Relatório de ensaio

O relatório do ensaio deverá incluir, pelo menos, as seguintes informações:

Substância de ensaio:

• identificação, características físicas e, se necessário, físico-químicas. Se forem utilizadas substâncias de referência, deverá ser também apresentada a mesma informação em relação a essas substâncias.

Condições do ensaio:

• procedimento de ensaio utilizado;

• descrição e justificação de eventuais modificações.

Resultados:

• tabelas com os valores de resistência (ensaio TER) ou com as percentagens de viabilidade celular (ensaio em modelo de pele humana) dos materiais de ensaio, dos controlos positivo e negativo e de qualquer produto químico padrão que tenha sido utilizado, incluindo todos os dados relativos aos replicados/repetição de experiências e valores médios;

• descrição de outros efeitos eventualmente observados.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4 Bibliografia

(nota 1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA, 26, pp. 275-280.

(nota 2) Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity 2, Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro, 12, pp. 483-524.

(nota 3) Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), «The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals», Toxicology in Vitro, 12, pp. 471-482.

(nota 4) Oliver, G. J. A., Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), «An in vitro skin corrosivity test - modifications and validation», Food & Chemical Toxicology, 24, pp. 507-512.

(nota 5) Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), «The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial», Toxicology in Vitro, 6, pp. 191-194.

(nota 6) Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), «An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion», ATLA, 26, pp. 709-720.

(nota 7) Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P. & Balls, M. (1995), «A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6», ATLA, 23, pp. 219-255.

FIGURA 1

Dimensões do tubo de PTFE

(ver figura no documento original)

Dimensões do eléctrodo

(ver figura no documento original)

FIGURA 2

Montagem para o ensaio TER em pele de rato

(ver figura no documento original)

ANEXO XII — B.41 Fototoxicidade - ensaio de fototoxicidade - in vitro 3T3 NRU

1 Método

1.1 Introdução

A fototoxicidade é definida como uma reacção tóxica decorrente da primeira exposição da pele a determinadas substâncias químicas, com posterior exposição à luz ou por irradiação da pele na sequência da administração sistémica de uma substância química.

A informação decorrente do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU é utilizada para definir o potencial fototóxico de uma substância em estudo, ou seja, a existência ou ausência de possíveis riscos associados a uma substância em estudo, por exposição à radiação UV e visível.

Dado que o objectivo toxicológico do ensaio in vitro consiste na determinação da fotocitotoxicidade decorrente da acção combinada de uma substância e de uma radiação, o ensaio permite identificar compostos que exibem fototoxicidade in vivo na sequência da sua administração sistémica e difusão na pele, bem como compostos fotoirritantes na sequência da sua aplicação tópica na pele.

O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foi elaborado e validado entre 1992 e 1997 no âmbito de um projecto conjunto UE/COLIPA (ver nota 1) (ver nota 2) (ver nota 3), com o objectivo de estabelecer um método in vitro válido destinado a substituir os diversos ensaios in vivo utilizados. Num seminário da OCDE realizado em 1996 foi recomendada a adopção de uma abordagem sequencial in vitro para avaliar a fototoxicidade (ver nota 4).

Os resultados do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foram comparados com os efeitos de fototoxicidade/fotoirritação aguda in vivo em animais e no homem, tendo o ensaio revelado uma excelente previsibilidade dos referidos efeitos. O ensaio não é concebido para detectar outros efeitos nocivos decorrentes da acção combinada das substâncias químicas e a das radiações, nomeadamente a fotogenotoxicidade, a fotoalergia e a fotocarcinogenicidade, embora muitas substâncias químicas que apresentam essas propriedades exibam uma reacção positiva no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. O ensaio não é também concebido para avaliar o potencial fototóxico.

O apêndice I apresenta abordagem sequencial para a determinação da fototoxicidade de substâncias químicas.

1.2 Definições

Irradiância: intensidade da radiação ultravioleta (UV) ou visível que incide numa superfície, expressa em W/m2 ou mW/cm2.

Dose de radiação: quantidade (= intensidade x tempo) de radiação ultravioleta (UV) ou visível que incide numa superfície, expressa em joules (= W x s) por unidade de superfície (por exemplo, J/m2 ou J/cm2).

Bandas de comprimentos de onda da radiação UV: as designações recomendadas pela CIE (Commission Internationale de l'Éclairage) são: UVA (315 nm-400 nm), UVB (280 nm-315 nm) e UVC (100 nm-280 nm). Utilizam-se também outras designações: o limite entre UVB e UVA é frequentemente situado a 320 nm, podendo as radiações UVA subdividir-se em UV-A1 e UV-A2, com uma separação a cerca de 340 nm.

Viabilidade celular: parâmetro que mede a actividade total de uma população celular (por exemplo, absorção do pigmento vital vermelho neutro pelos lisosomas celulares); em função da variável determinada e do tipo de ensaio realizado, é possível correlacionar a viabilidade celular com o número total e ou a vitalidade das células.

Viabilidade celular relativa: viabilidade celular expressa em relação aos ensaios de controlo negativos (apenas com o solvente) efectuados ao longo do procedimento de ensaio (+UV ou -UV), na ausência da substância em estudo.

Modelo de previsão: algoritmo utilizado para transformar os resultados de um ensaio de toxicidade numa previsão do potencial de toxicidade: No âmbito das presentes directrizes de ensaio, podem utilizar-se os parâmetros PIF e MPE para transformar os resultados do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU numa previsão do potencial fototóxico.

PIF (photo irritation factor - Factor de fotoirritação): factor obtido por comparação entre duas concentrações citotóxicas igualmente eficazes (EC(índice 50)) da substância em estudo, respectivamente sem (-UV) e com exposição (+UV) a uma dose não citotóxica de radiação UVA/visível.

MPE (mean photo effect - Fotoefeito médio): parâmetro obtido por tratamento matemático do traçado de duas curvas concentração-efeito obtidas, respectivamente, sem (-UV) e com (+UV) exposição a uma dose não citotóxica de radiação UVA/visível.

Fototoxicidade: reacção tóxica aguda decorrente da exposição da pele a determinadas substâncias químicas e sua posterior exposição à luz, ou por irradiação da pele após a administração sistémica de uma substância química.

Fotoirritação: subcategoria do termo «fototoxicidade» utilizada apenas para descrever as reacções fototóxicas da pele decorrentes da exposição, por aplicação tópica ou administração oral, a substâncias químicas. As referidas reacções fototóxicas provocam sempre danos celulares não específicos (do tipo eritema solar).

Fotoalergia: reacção imunológica adquirida, que não ocorre na sequência da primeira exposição à substância química e à radiação, sendo necessário um período de indução de uma ou duas semanas para que se observe reacção cutânea.

Fotogenotoxicidade: reacção genotóxica observada para um parâmetro genético, produzido na sequência da exposição das células a uma dose não genotóxica de radiação UV/visível e a uma substância química não genotóxica.

Fotocarcinogenicidade: carcinogenicidade induzida pela exposição repetida às radiações e a uma substância química. Utiliza-se o termo «fotocarcinogénese» quando o efeito cancerígeno das radiações UV é reforçado pela exposição a uma substância química.

1.3 Substâncias de referência

Além da clorpromacina utilizada para o controlo positivo, que deve ser analisada paralelamente em cada ensaio, recomenda-se a utilização como substâncias de referência no ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU de um subconjunto das substâncias químicas utilizadas para o mesmo fim nos ensaios interlaboratoriais (ver nota 1) (ver nota 3) (ver nota 13).

1.4 Considerações preliminares

Existem inúmeras referências aos efeitos fototóxicos de muitas substâncias (ver nota 5) (ver nota 6) (ver nota 7) (ver nota 8). A única característica comum das referidas substâncias consiste na capacidade de absorver a energia luminosa da radiação solar. De acordo com a primeira lei da fotoquímica (lei de Grotthaus-Draper), é necessária a absorção de uma quantidade suficiente de quanta de luz para que se observe fotorreacção. Deste modo, antes de realizar um ensaio biológico em conformidade com as presentes directrizes, deve determinar-se o espectro de absorção no UV/visível da substância em estudo (por exemplo de acordo com a directriz 101 da OCDE). Caso o coeficiente de extinção/absorção molar seja inferior a 10 l x mol(elevado a -1) x cm(elevado a -1), a substância carece de potencial fotorreactivo, não sendo necessário submetê-la ao ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU nem a qualquer outro ensaio biológico para a determinação de efeitos fotoquímicos nocivos (apêndice I).

1.5 Princípio de método

Foram identificados quatro mecanismos mediante os quais a absorção de luz por um cromóforo pode ocasionar uma reacção fototóxica (ver nota 7): todos os referidos mecanismos se traduzem em danos celulares. Deste modo, o ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU baseia-se na comparação da citotoxicidade de uma substância submetida a ensaio com ou sem exposição a uma dose não citotóxica de radiação UVA/visível. No âmbito do ensaio, a citotoxicidade é expressa numa redução, em termos de concentração, da absorção do pigmento vermelho neutro vital [neutral red - NR (ver nota 9)] 24 horas após a administração da substância em estudo e a irradiação.

Efectua-se uma cultura de células Balb/c 3T3 durante 24 horas, até à formação de monocamadas. Para cada substância em estudo, procede-se à pré-incubação, durante 1 hora, de duas placas de 96 alvéolos com oito concentrações diferentes da substância. Expõe-se uma das placas a uma dose não citotóxica de 5 J/cm2 UVA (experiência +UV), mantendo-se a outra na obscuridade (experiência -UV). Seguidamente, o meio de tratamento é substituído, em ambas as placas, por um meio de cultura: após uma nova incubação de 24 horas, determina-se a viabilidade celular por análise da absorção do vermelho neutro (neutral red uptake - NRU) durante 3 horas. Calcula-se a viabilidade celular relativa, expressa em percentagem das amostras de controlo isentas da substância em estudo, para cada uma das oito concentrações de ensaio. Para a previsão do potencial fototóxico, comparam-se as reacções, em termos de concentrações, obtidas com (+UV) e sem (-UV) irradiação, em geral ao nível EC(índice 50), ou seja, a concentração que inibe a viabilidade celular em 50% relativamente às amostras de controlo isentas da substância.

1.6 Critérios de qualidade

Sensibilidade das células às radiações UVA - dados de referência: deve comprovar-se periodicamente a sensibilidade das células às radiações UVA. Para tal, as células são inoculadas à densidade utilizada no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU e irradiam-se as mesmas, no dia seguinte, com uma dose de 1 a 9 J/cm2 de radiação UVA. Um dia depois determina-se a viabilidade celular através do ensaio NRU. As células satisfazem os critérios de qualidade se, na sequência da irradiação com 5 J/cm2 UVA, a sua viabilidade for superior ou igual a 80% da viabilidade das amostras mantidas na obscuridade. A viabilidade obtida utilizando a dose máxima de radiação UVA de 9 J/cm2 não deve ser inferior a 50% da obtida com as amostras mantidas na obscuridade. O processo deve repetir-se aproximadamente em cada 10 passagens celulares.

Sensibilidade das células das amostras de controlo negativas à radiação UVA - ensaio em curso: o ensaio satisfaz os critérios de qualidade se as amostras de controlo negativas [células numa solução salina equilibrada de Earl (earl's balanced salt solution - EBSS) contendo ou não 1% de dimetilssulfóxido (DMSO) ou 1% de etanol (EtOH)] no ensaio +UVA apresentarem uma viabilidade igual ou superior a 80% da das células não irradiadas, no mesmo solvente, no ensaio paralelo realizado na obscuridade (-UVA).

Viabilidade das amostras de controlo negativas: a densidade óptica absoluta (OD(índice 540 NRU)) determinada no extracto NR das amostras de controlo negativas indica se as 1 x 10(elevado a 4) células inoculadas por alvéolo apresentam um tempo de replicação normal no decurso dos dois dias do ensaio. O ensaio satisfaz os critérios se a densidade óptica média (OD(índice 540 NRU)) das amostras de controlo não tratadas for igual ou superior a 0,2.

Controlo positivo: paralelamente a cada ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU deve efectuar-se um ensaio com uma substância fototóxica conhecida. Recomenda-se a utilização de clorpromacina (CPZ), substância de controlo positivo utilizada no estudo de validação EU/COLIPA. Foram definidos os seguintes critérios de aceitação para o uso de CPZ em conformidade com o protocolo normalizado do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU: CPZ irradiada (+UVA), EC(índice 50) = 0,1 (mi)g/ml a 2,0 (mi)g/ml; CPZ não irradiada (-UVA), EC(índice 50) = 7,0 (mi)g/ml a 90,0 (mi)g/ml. O factor de fotoirritação (PIF), ou seja, a variação da EC(índice 50) deve ser de, pelo menos, 6.

Em vez da CPZ podem utilizar-se nos referidos controlos positivos paralelos outras substâncias fototóxicas conhecidas, adequadas à categoria química ou às características de solubilidade da substância em estudo. Neste caso, devem definir-se como critérios de aceitação para o ensaio, com base nos dados acumulados, os intervalos dos valores da EC(índice 50) e o PIF ou o MPE.

1.7 Descrição do método

1.7.1 Preparação

1.7.1.1 Células

Recomenda-se a utilização de uma linhagem celular permanente de fibroblastos de rato - Balb/c 3T3, clon 31 - proveniente do ATCC ou ECACC, idêntica à utilizada no ensaio de validação. Podem também obter-se resultados satisfatórios por recurso a outras células ou linhagens celulares, aplicando o mesmo protocolo de ensaio, se as condições de cultura forem adequadas às necessidades específicas das células; todavia, nesse caso, é necessário demonstrar a equivalência.

Deve comprovar-se regularmente que as células não estão contaminadas por micoplasmas, devendo as mesmas apenas ser utilizadas se os resultados das referidas comprovações forem satisfatórios.

Uma vez que a sensibilidade das células às radiações UVA pode aumentar com o número de passagens, devem utilizar-se células Balb/c 3T3 que tenham sido objecto do menor número possível de passagens, preferivelmente menos de 100. Deve comprovar-se periodicamente a sensibilidade das células Balb/c 3T3 às radiações UVA por recurso ao procedimento de controlo de qualidade descrito nas presentes directrizes.

1.7.1.2 Meios e condições de cultura

Devem utilizar-se meios de cultura e condições de incubação adequados às passagens celulares comuns e ao procedimento de ensaio. No caso das células Balb/c 3T3, recomenda-se o uso de DMEM enriquecido com 10% de soro de bovino recém-nascido, 4 mM de glutamina, penicilina e estreptomicina, incubado a 37ºC numa atmosfera húmida com 7,5% de CO(índice 2). É particularmente importante que as condições de cultura celular permitam manter o ciclo celular nos valores normais das células ou da linhagem celular utilizadas.

1.7.1.3 Preparação das culturas

Inoculam-se num meio de cultura de densidade adequada células provenientes de culturas-mãe congeladas, efectuando-se pelo menos uma subcultura antes de utilizá-las no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU.

Para o ensaio de fototoxicidade, inoculam-se as células num meio de cultura de densidade tal que impeça a confluência das culturas antes do termo do ensaio, ou seja, aquando da determinação da viabilidade celular 48 horas após a inoculação das células. No caso das células Balb/c 3T3 cultivadas em placas de 96 alvéolos, recomenda-se uma densidade de 1 x 10(elevado a 4) células por alvéolo.

Para cada substância em estudo, inoculam-se as células de modo idêntico em duas placas diferentes de 96 alvéolos, mantendo-se as condições de cultura ao longo de todo o ensaio, excepto durante o período de irradiação de uma das substâncias (+radiação UVA/visível), enquanto que a outra se mantém na obscuridade (-radiação UVA/visível).

1.7.1.4 Activação metabólica

Embora, de modo geral, seja necessário recorrer a sistemas de activação metabólica para todos os ensaios in vitro de previsão do potencial genotóxico ou carcinogénico, no domínio da fototoxicologia não se conhece ainda qualquer substância química que necessite de uma transformação metabólica para actuar como fototoxina in vivo ou in vitro. Por conseguinte, não se considera necessário nem cientificamente justificado utilizar um sistema de activação metabólica no presente ensaio.

1.7.1.5 Substância em estudo - Preparação

As substâncias devem preparar-se imediatamente antes da utilização, excepto se os dados de estabilidade mostrarem que é possível armazená-las. Caso seja provável a ocorrência de fotodegradação rápida, pode ser necessário preparar as referidas substâncias à luz vermelha.

As substâncias em estudo são dissolvidas em soluções-tampão salinas, tais como uma solução salina equilibrada de Earl (EBSS) ou uma solução-tampão salina de fosfatos (phosphate buffered saline - PBS), que não devem conter componentes proteicos nem corantes indicadores de pH que absorvam a luz, de modo a evitar interferências durante a irradiação.

As substâncias de ensaio fracamente solúveis em água devem dissolver-se em solventes adequados numa concentração 100 vezes superior à concentração final desejada, diluindo-se de seguida na proporção 1:100 com a solução-tampão salina. Caso se utilize um solvente, a sua concentração volúmica deve permanecer constante (1%) em todas as culturas, isto é, tanto nas amostras de controlo negativo como nas amostras da substância em estudo em todas as concentrações.

Recomenda-se o uso do dimetilssulfóxido (DMSO) e do etanol (EtOH) como solventes. Podem utilizar-se outros solventes de citotoxicidade reduzida (por exemplo, acetona), devendo contudo avaliar-se devidamente as suas propriedades específicas, nomeadamente a possibilidade de reagir com a substância em estudo, de reduzir o efeito fototóxico ou de captar radicais.

Se necessário, pode recorrer-se a um agitador mecânico, a um banho de ultra-sons e ou ao aquecimento a 37ºC para facilitar a dissolução.

1.7.1.6 Irradiação com UV - Preparação

Fonte de radiação: a escolha de uma fonte de radiação e de uma filtração adequadas constitui o factor determinante dos ensaios de fototoxicidade. As regiões do visível e do UVA encontram-se, em geral, associadas à fotossensibilização (ver nota 7) (ver nota 10), enquanto que a gama do UVB possui menor importância neste domínio, apresentando em contrapartida uma elevada citotoxicidade directa que é multiplicada por 1000 entre 313 nm e 280 nm (ver nota 11). Os critérios de selecção da fonte de radiação adequada devem incluir o requisito essencial da emissão de comprimentos de onda que a substância em estudo absorve: por outro lado, a dose de luz (passível de ser obtida num período razoável) deve ser suficiente para detectar os fotossensibilizadores conhecidos. Além disso, os comprimentos de onda e as doses utilizadas não devem causar danos desnecessários ao sistema em estudo, nomeadamente devido à emissão de calor (região do infravermelho).

Considera-se que a melhor fonte de luz é produzida por simuladores de radiação solar, que utilizam arcos de xénon ou arcos de mercúrio dopado-halogeneto de metal. Estes últimos apresentam a vantagem de emitir menos calor e de ser mais económicos, mas não reproduzem exactamente a luz solar. Dado que todos os simuladores de radiação solar emitem quantidades consideráveis de radiação UVB, devem utilizar-se filtros adequados para atenuar os respectivos comprimentos de onda altamente citotóxicos.

No ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU deve utilizar-se um espectro de irradiância praticamente isento de UVB (UVA:UVB ~ 1:20). A referência 3 inclui um exemplo da distribuição da irradiância espectral do simulador de radiação solar filtrada utilizado na validação do ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (ver nota 3).

Dosimetria: antes de cada ensaio de fototoxicidade deve comprovar-se a intensidade da radiação (irradiância) por recurso a um medidor de UV de banda larga adequado, previamente calibrado em função da fonte de radiação. Deve comprovar-se o desempenho do aparelho, recomendando-se para tal a utilização de um segundo medidor de UV de referência do mesmo tipo, calibrado do mesmo modo. A utilização, a intervalos superiores, de um espectrorradiómetro para medir a irradiância espectral da fonte de luz filtrada e comprovar a calibração do medidor de UV de banda larga constitui a solução ideal, embora a manipulação dos instrumentos em causa necessite de pessoal devidamente qualificado.

O ensaio de validação mostrou que a dose de 5 J/cm2 (UVA) não apresenta citotoxicidade para as células Balb/c 3T3, sendo suficientemente potente para activar as substâncias químicas fracamente fototóxicas. Para obter 5 J/cm2 no período de 50 minutos, deve ajustar-se a irradiância a 1,666 mW/cm2. Caso se utilize outra linhagem celular ou outra fonte de radiação, pode ser necessário adaptar ligeiramente a dose de raios UVA de um modo que não danifique as células e seja suficiente para detectar as fototoxinas de referência. A duração da exposição é calculada de acordo com a expressão:

t (min) = [(dose de irradiação (J/cm2) x 1000)/(irradiância (mW/cm2) x 60)] (1 J = 1 W seg)

1.7.2 Condições de ensaio

A concentração máxima da substância em estudo não deve exceder 100 mg/ml, uma vez que todas as substâncias fototóxicas foram detectadas a concentrações inferiores: além disso, a concentrações superiores, aumenta a incidência de falsos resultados positivos (ver nota 13). O pH da concentração mais elevada da substância em estudo deve ser adequado (compreendido entre 6,5 e 7,8).

Devem determinar-se de forma adequada, em ensaios prévios, as gamas de concentração da substância em estudo com (+UVA) e sem (-UVA) irradiação. A gama e o intervalo de uma série de concentrações devem ajustar-se de modo que as curvas concentração-resposta sejam fundamentadas experimentalmente. Devem utilizar-se concentrações em progressão geométrica, com um factor de diluição constante.

1.7.3 Procedimento (ver nota 1)

1.7.3.1 Primeiro dia

Prepara-se uma suspensão de 1 x 10(elevado a 5) células/ml no meio de cultura e colocam-se 100 ml de meio de cultura apenas nos alvéolos periféricos de uma placa de microtitulação de 96 alvéolos (= ensaios em branco). Nos restantes alvéolos colocam-se 100 ml de suspensão de 1 x 10(elevado a 5) células/ml (= 1 x 10(elevado a 4) células/alvéolo). Preparam-se duas placas com cada substância em estudo, destinando-se uma a determinar a citotoxicidade (-UVA) e a outra a fotocitotoxicidade (+UVA).

Incubam-se as células durante 24 horas (7,5% CO(índice 2), 37ºC) até à formação de uma monocamada semiconfluente. O referido período de incubação permite a recuperação, a aderência e o crescimento exponencial das células.

1.7.3.2 Segundo dia

Após a incubação, decanta-se o meio de cultura celular e efectuam-se, por alvéolo, duas lavagens com 150 (mi)l de EBSS/PBS. Adicionam-se 100 (mi)l de EBSS/PBS com a concentração adequada da substância em estudo ou, no caso das amostras de controlo negativo, apenas solvente. Adicionam-se oito concentrações diferentes da substância em estudo. Incubam-se as células com a substância em estudo durante 60 minutos, na obscuridade (7,5% CO(índice 2), 37ºC).

Na componente (+UVA) do ensaio, irradiam-se as células durante 50 minutos, à temperatura ambiente, através da cobertura da placa de 96 alvéolos, com uma dose de 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Utilizar um ventilador para evitar a condensação de água sob a cobertura. Para o ensaio (-UVA), colocar na obscuridade a segunda série de placas, à temperatura ambiente, durante 50 minutos (= tempo de exposição aos raios UVA).

Decanta-se a solução de ensaio, efectuando duas lavagens com 150 ml de EBSS/PBS. Substitui-se a EBSS/PBS pelo meio de cultura e incuba-se (7,5% CO(índice 2), 37ºC) até ao dia seguinte (18-22 horas).

1.7.3.3 Terceiro dia

Análise microscópica:

Examinam-se as células num microscópio com dispositivo de contraste de fase. Registam-se as alterações morfológicas das células devidas aos efeitos citotóxicos da substância em estudo. A comprovação em causa é recomendada com o objectivo de excluir erros experimentais, embora as observações efectuadas no seu âmbito não sejam utilizadas para avaliar a citotoxicidade nem a fototoxicidade.

Ensaio de absorção do vermelho neutro:

Lavam-se as células com 150 (mi)l de EBSS/PBS pré-aquecida. Remove-se a solução de lavagem sacudindo ligeiramente. Adicionam-se 100 (mi)l de meio com NR e incuba-se durante 3 horas a 37ºC, em atmosfera húmida com 7,5% CO(índice 2).

Após a incubação, elimina-se o meio com NR e lavam-se as células com 150 ml de EBSS/PBS. Decanta-se e enxuga-se totalmente a EBSS/PBS. (Alternativa: centrifugar a placa invertida.)

Adicionam-se exactamente 150 (mi)l de solução de desorção do NR (solução de etanol/ácido acético recentemente preparada).

Agita-se rapidamente a placa num agitador de microplacas durante 10 minutos, até que o NR seja extraído das células e forme uma solução homogénea.

Mede-se a densidade óptica do extracto de NR a 540 nm num espectrofotómetro, utilizando como referência os ensaios em branco. Armazenam-se os dados num ficheiro de formato adequado (por exemplo, ASCII), com vista ao seu tratamento posterior.

2 Resultados

2.1 Qualidade e quantidade dos resultados

Os dados devem permitir uma análise significativa das respostas obtidas para cada concentração, com e sem irradiação UVA/visível. Caso se observe fototoxicidade, tanto a gama de concentrações como o intervalo entre cada concentração devem ser estabelecidos de modo que permitam adaptar o traçado de uma curva aos dados experimentais. Uma vez que a substância em estudo pode não produzir efeitos citotóxicos à concentração-limite de 100 mg/ml definida para o ensaio realizado na obscuridade (-UVA), exibindo todavia uma elevada citotoxicidade no ensaio com irradiação (+UVA), pode ser necessário utilizar em cada componente do ensaio gamas de concentração de magnitude diversa, de modo a obter resultados de qualidade adequada. Caso não se observe citotoxicidade em nenhuma das componentes do ensaio (-UVA e +UVA), bastará utilizar concentrações separadas por um intervalo apreciável, até à concentração máxima.

Não é necessário comprovar um resultado claramente positivo, repetindo o ensaio. Os resultados claramente negativos não necessitam também de comprovação caso o ensaio tenha sido realizado com concentrações suficientemente altas. Nessas circunstâncias, bastará realizar um ensaio principal e um ou vários ensaios prévios com o objectivo de definir as gamas de concentração.

Os ensaios cujos resultados se situem no limite do modelo de predição devem ser repetidos para fins comprovativos.

Caso se considere necessário repetir o ensaio, pode ser importante alterar as condições experimentais de modo a obter um resultado inequívoco. Neste contexto, a preparação das soluções da substância constitui um aspecto fundamental. A alteração das referidas condições, expressa, por exemplo, na utilização de co-solventes, na trituração da amostra ou na utilização de um banho de ultra-sons, pode, pois, revelar-se fundamental. Como alternativa, pode também alterar-se o período da incubação antes da irradiação: no caso de substâncias instáveis em água, pode ser conveniente reduzir o referido período.

2.2 Tratamento dos resultados

Se possível, deve determinar-se a concentração de substância em estudo que induz uma inibição de 50% da absorção celular de vermelho neutro (EC(índice 50)). Para tal, pode aplicar-se aos resultados de concentração-resposta qualquer método de regressão não linear adequado (de preferência, uma função de Hill ou uma regressão logística) ou outros métodos de ajustamento (ver nota 14). Antes de utilizar um determinado valor de EC(índice 50) nos cálculos posteriores, deve comprovar-se devidamente a qualidade do ajustamento. Podem também utilizar-se no cálculo do valor de EC(índice 50) métodos de ajustamento gráfico. Nesse caso, recomenda-se a utilização de papel probabilístico (eixo x: log, eixo y: probit), uma vez que, frequentemente, a função concentração-resposta se torna praticamente linear na sequência da transformação.

2.3 Avaliação dos resultados (modelos de previsão)

2.3.1 Modelo de previsão - versão 1: factor de fotoirritação (PIF)

Se, tanto em presença (+UVA) como na ausência (-UVA) de radiação, se obtiverem curvas concentração-resposta completas, pode calcular-se o factor de fotoirritação (PIF) por recurso à fórmula seguinte:

A obtenção de um valor PIF<5 traduz a ausência de potencial fototóxico, enquanto que um PIF >= 5 traduz a existência de potencial fototóxico.

Se uma substância se revelar citotóxica quando irradiada (+UVA) mas não na ausência de irradiação (-UVA), não é possível calcular o PIF, embora o referido resultado indique a existência de potencial fototóxico. Em tais casos, pode calcular-se um valor > PIF se o ensaio de citotoxicidade (-UV) tiver decorrido até à concentração de ensaio máxima (C(índice máx)), valor que se utiliza no cálculo de > PIF:

Caso se obtenha apenas um valor > PIF, qualquer valor superior a 1 traduz um potencial fototóxico.

Se não for possível calcular a EC(índice 50) (-UV) nem a EC(índice 50) (+UV) porque a substância não produz efeitos citotóxicos mesmo à concentração de ensaio máxima, tal significa que a substância não possui potencial fototóxico. Nessas condições, utiliza-se um PIF = *1 teórico para caracterizar o resultado.

Caso se obtenha apenas um valor «PIF = *1», o ensaio traduz a ausência de potencial fototóxico.

Nos casos b) e c), devem tomar-se na devida conta as concentrações obtidas no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU aquando da previsão do potencial fototóxico.

2.3.2 Modelo de previsão - versão 2: fotoefeito médio (MPE)

Como alternativa, pode utilizar-se uma nova versão do modelo de previsão do potencial fototóxico elaborada com base nos dados obtidos no estudo de validação EU/COLIPA (ver nota 15) e comprovada num ensaio «cego» realizado no âmbito de um estudo posterior relativo à fototoxicidade in vitro de substâncias utilizadas como filtros de UV (ver nota 13). Este modelo permite superar a limitação do modelo baseado no PIF nos casos em que não é possível obter um valor de EC(índice 50). O modelo utiliza o fotoefeito médio (MPE), que constitui um parâmetro baseado na comparação das curvas concentração-resposta, na sua totalidade. A Universidade Humboldt de Berlim elaborou um programa informático especial para a aplicação do modelo MPE, que pode obter-se gratuitamente.

2.4 Interpretação dos resultados

A obtenção de um resultado positivo no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (PIF >= 5 ou MPE >= 0,1) indica que a substância em estudo apresenta potencial fototóxico. Se o referido resultado foi obtido com concentrações inferiores a 10 mg/ml, é provável que a substância em estudo apresente também efeitos fototóxicos em diversas condições de exposição in vivo. Caso se obtenha um resultado positivo apenas com a concentração de ensaio máxima de 100 mg/ml, pode ser necessário, para avaliar o perigo ou o poder fototóxico, ter em conta outros aspectos, tais como a penetração e a absorção cutâneas e a possível acumulação da substância na pele, ou submeter a substância a outro tipo de ensaios, com o objectivo de confirmar os resultados, utilizando, por exemplo, um modelo de pele humana in vitro.

A obtenção de um resultado negativo no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU (PIF<5 ou MPE<0,1) indica que a substância em estudo não apresenta efeitos fototóxicos nas células de mamífero cultivadas nas condições em causa. Se for possível submeter a substância a ensaio até à concentração máxima de 100 mg/ml, a obtenção de um resultado negativo indica que a mesma não possui de potencial fototóxico, sendo improvável que produza efeitos fototóxicos in vivo. Nos casos em que se obtenham reacções tóxicas idênticas (EC(índice 50) + UV e EC(índice 50) - UV) com concentrações inferiores, devem interpretar-se os dados do mesmo modo. Todavia, caso não se observe toxicidade (+UV e -UV) e a solubilidade em água da substância em estudo tenha limitado as concentrações utilizadas a menos de 100 mg/ml, pode questionar-se a compatibilidade da substância com o método de ensaio, devendo encarar-se a possibilidade de realizar um ensaio de confirmação (por exemplo, com um modelo de pele in vitro ou ex vivo, ou um ensaio in vivo).

3 Relatório

Relatório do ensaio

O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:

Substância em estudo:

• dados de identificação e número CAS, se conhecido;

• natureza física e pureza;

• propriedades físico-químicas relevantes para a realização do estudo;

• estabilidade e fotoestabilidade, se conhecidas.

Solvente:

• justificação da escolha do solvente;

• solubilidade da substância em estudo no solvente;

• percentagem de solvente presente no meio de tratamento (EBSS ou PBS).

Células:

• tipo e proveniência das células;

• ausência de micoplasma;

• número de passagens celulares, se conhecido.

• sensibilidade das células à radiação UVA, determinada com o equipamento de irradiação utilizado no ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU.

Condições de ensaio a) - incubação antes do tratamento e após o mesmo:

• tipo e composição do meio de cultura;

• condições de incubação (concentração de CO(índice 2), temperatura e humidade);

• duração da incubação (tratamento prévio e posterior).

Condições de ensaio b) - tratamento com a substância:

• fundamentação da escolha das concentrações da substância em estudo utilizadas nos ensaios com e sem irradiação UV/visível;

• caso a substância em estudo seja fracamente solúvel e não citotóxica, fundamentação da escolha da maior concentração utilizada;

• tipo e composição do meio de tratamento (solução-tampão salina);

• duração do tratamento químico.

Condições de ensaio c) - irradiação:

• fundamentação da escolha da fonte de radiação utilizada;

• características da irradiância espectral da fonte de radiação;

• características de transmissão/absorção do filtro ou filtros utilizados;

• características do radiómetro e condições de calibração;

• distância entre a fonte de radiação e o sistema de ensaio;

• irradiância UVA à referida distância, expressa em mW/cm2;

• duração da exposição à radiação UV/visível;

• dose de radiação UVA (irradiância x tempo), expressa em J/cm2;

• temperatura utilizada para as culturas celulares irradiadas e as culturas mantidas na obscuridade.

Condições de ensaio d) - ensaio NRU:

• composição do meio NR;

• duração da incubação em NR;

• condições de incubação (concentração de CO(índice 2), temperatura e humidade);

• condições de extracção do NR (agente de extracção, duração);

• comprimento de onda utilizado para a leitura espectrofotométrica da densidade óptica do NR;

• segundo comprimento de onda (referência), se aplicável;

• substância utilizada para o ensaio em branco do espectrofotómetro, se aplicável.

Resultados:

• viabilidade celular obtida para cada concentração da substância em estudo, expressa em percentagem da viabilidade média dos controlos;

• curvas concentração-resposta (concentração da substância em estudo - viabilidade celular relativa), obtidas nos ensaios +UVA e -UVA paralelos;

• análise dos dados provenientes das curvas concentração-resposta: se possível, cálculo automático/cálculo do valor de EC(índice 50) (+UVA) e EC(índice 50) (-UVA);

• comparação das duas curvas concentração-resposta obtidas com e sem irradiação UVA/visível, calculando o factor de fotoirritação (PIF) ou o fotoefeito médio (MPE).

• classificação do potencial fototóxico;

• critérios de aceitação do ensaio a) - controlo negativo paralelo:

• viabilidade absoluta (densidade óptica do extracto de NR) das células irradiadas e as não irradiadas;

• dados de referência do controlo negativo, média e desvio padrão;

critérios de aceitação do ensaio b) - controlo positivo paralelo;

• EC(índice 50) (+UVA), EC(índice 50) (-UVA) e PIF da substância de controlo positivo;

• dados de referência da substância de controlo positivo: EC(índice 50) (+UVA), EC(índice 50) (-UVA) e PIF, média e desvio padrão.

Discussão dos resultados.

Conclusões.

4 Bibliografia

(nota 1) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H. G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannenbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro, 8, pp. 793-796.

(nota 2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, pp. 7-8.

(nota 3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA «In vitro phototoxicity» validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, pp. 305-327.

(nota 4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.

(nota 5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro, 7, pp. 95-102.

(nota 6) Santamaria, L., and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry, vol. 3, part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, pp. XI-XXXV.

(nota 7) Spielmann, H., Lovell, W. W., Hölzle, E., Johnson, B. E., Mauren, T., Miranda, M. A., Pape, W. J. W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA, 22, pp. 314-348.

(nota 8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, pp. 79-110.

(nota 9) Borenfreund, E., and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters, 24, pp. 119-124.

(nota 10) Lambert, L. A., Warner, W. G., and Kornhauser, A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th edition, pp. 515-530.

(nota 11) Tyrrell, R. M., and Pidoux, M. (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research, 47, pp. 1825-1829.

(nota 12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project «in vitro Photoirritation».

(nota 13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potencial of UV Filter Chemicals from annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA, 26, pp. 679-708.

(nota 14) Holzhütter, H. G., and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems, 3, pp. 127-138.

(nota 15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of doseresponse curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA, 25, pp. 445-462.

(nota 1) A referência bibliográfica 12 contém informações complementares.

APÊNDICE

Papel do ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU numa abordagem sequencial dos ensaios de fototoxicidade de substâncias químicas

(ver figura no documento original)

ANEXO XIII — «ANEXO VI

Critérios gerais de classificação e de rotulagem das substâncias e preparações perigosas

Índice

1 Introdução geral.

2 Classificação com base nas propriedades físico-químicas:

2.1 Introdução.

2.2 Critérios para a classificação, escolha de símbolos, indicação de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:

2.2.1 Explosivo.

2.2.2 Comburente.

2.2.3 Extremamente inflamável.

2.2.4 Facilmente inflamável.

2.2.5 Inflamável.

2.2.6 Outras propriedades físico-químicas.

3 Classificação com base nas propriedades toxicológicas:

3.1 Introdução.

3.2 Critérios para a classificação, escolha de símbolos, indicação de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:

3.2.1 Muito tóxico.

3.2.2 Tóxico.

3.2.3 Nocivo.

3.2.4 Comentários relativos à utilização da frase R48.

3.2.5 Corrosivo.

3.2.6 Irritante.

3.2.7 Sensibilizante.

3.2.8 Outras propriedades toxicológicas.

4 Classificação com base em efeitos específicos na saúde humana:

4.1 Introdução.

4.2 Critérios para a classificação, indicação de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:

4.2.1 Substâncias carcinogénicas.

4.2.2 Substâncias mutagénicas.

4.2.3 Substâncias com efeitos tóxicos na reprodução.

4.2.4 Processo para a classificação de preparações.

5 Classificação com base em efeitos no ambiente:

5.1 Introdução.

5.2 Critérios para a classificação, indicação de perigos e escolha de frases indicadoras de riscos:

5.2.1 Ambiente aquático.

5.2.2 Ambiente não aquático.

6 Escolha das recomendações de prudência:

6.1 Introdução.

6.2 Recomendações de prudência relativas a substâncias e preparações.

7 Proposta de rotulagem.

8 Casos especiais: substâncias:

8.1 Garrafas para gases transportáveis.

8.2 Garrafas para gases destinadas ao propano, butano ou gás de petróleo liquefeito (GPL).

8.3 Metais numa forma maciça.

8.4 Substâncias classificadas com a frase R65.

9 Casos especiais: preparações:

9.1 Preparações gasosas (misturas de gases).

9.2 Garrafas para gases destinadas a preparações com propano, butano ou gás de petróleo liquefeito (GPL) a que foram adicionados odorizantes.

9.3 Ligas, preparações com polímeros e preparações com elastómeros.

9.4 Preparações classificadas com a frase R65.

9.5 Peróxidos orgânicos.

1 Introdução geral

1.1 O objectivo da classificação é identificar todas as propriedades toxicológicas, físico-químicas, e ecotoxicológicas das substâncias e as propriedades toxicológicas e físico-químicas das preparações que possam representar um risco durante a manipulação ou utilização normais. Identificada qualquer propriedade perigosa, a substância ou preparação deve ser rotulada de modo que os perigos sejam indicados, a fim de proteger o utilizador, o público em geral e o ambiente.

1.2 O presente anexo estabelece os princípios gerais orientadores da classificação e rotulagem das substâncias e preparações referidas no artigo 5.º do presente Regulamento e no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho, bem como noutra legislação relevante relativa a preparações perigosas.

Destina-se a todas as pessoas (produtores, importadores e autoridades nacionais) envolvidas nos processos de classificação e rotulagem de substâncias e preparações perigosas.

1.3 As disposições do presente Regulamento e do Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho, têm por objectivo pôr à disposição do público em geral e dos trabalhadores um instrumento fundamental capaz de fornecer as informações essenciais relativas às substâncias e preparações perigosas. O rótulo chama a atenção das pessoas que manipulam ou utilizam essas substâncias e preparações para os perigos inerentes a alguns desses materiais.

O rótulo também pode servir para chamar a atenção para informações mais completas sobre o produto, relativas a segurança e utilização, apresentadas noutras formas.

1.4 O rótulo deve atender a todos os perigos potenciais relacionados com a manipulação e utilização normais das substâncias e preparações perigosas, na forma em que são colocadas no mercado mas não necessariamente noutras formas possíveis de utilização final, por exemplo diluídas. Os perigos mais graves são realçados por símbolos, e tanto esses perigos como os que decorrem de outras propriedades perigosas são especificados em frases normalizadas indicadoras de riscos. Por outro lado, com as recomendações de prudência formulam-se conselhos relativos às precauções a tomar.

No caso das substâncias, a informação é completada pela sua designação de acordo com uma nomenclatura química reconhecida internacionalmente, de preferência a designação que é utilizada no Inventário Europeu das Substâncias Químicas Existentes no Mercado (EINECS) ou na Lista Europeia das Substâncias Químicas Notificadas (ELINCS), pelo número CE e pela menção do nome, morada e número de telefone da pessoa estabelecida na Comunidade e responsável pela colocação da substância no mercado.

No caso das preparações, a informação é completada pela designação ou pelo nome comercial da preparação, pela designação química das substâncias que a compõem, nos termos do Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho, e pela indicação do nome, morada e número de telefone da pessoa estabelecida na Comunidade e responsável pela colocação da preparação no mercado.

1.5 O Decreto-Lei n.º 82/95, de 22 de Abril, e o presente Regulamento estipulam que os produtores, distribuidores e importadores de substâncias perigosas que figurem no EINECS mas que ainda não constem no anexo I, devem ser obrigados a proceder a investigações que os levem a tomar conhecimento dos dados relevantes disponíveis relativos às propriedades dessas substâncias. Com base nessas informações, devem embalar e rotular provisoriamente as referidas substâncias em questão, de acordo com as regras estabelecidas no n.º 3 do artigo 2.º do Decreto-Lei n.º 82/95, de 22 de Abril, nos artigos 17.º a 20.º do presente Regulamento e com os critérios do anexo VI.

1.6 Em relação às substâncias, os dados necessários para a classificação e rotulagem podem ser obtidos da seguinte forma:

Em relação às preparações, os dados necessários para a classificação e rotulagem podem ser obtidos da seguinte forma:

• por aplicação dos métodos especificados no anexo V e ou por aplicação do método convencional referido na subsecção III, artigos 12.º ao 17.º, da Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, na redacção que lhe foi dada pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho, ou, no caso da frase R65, pela aplicação das normas especificadas em 3.2.3;

• no entanto, tratando-se da avaliação de propriedades cancerígenas, mutagénicas e de toxicidade para a reprodução, aplicar-se-á o método convencional referido na subsecção III, artigos 18.º ao 20.º, da Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, na redacção que lhe foi dada pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho.

Nota relativa à realização de ensaios com animais

A realização de ensaios com animais para a obtenção de dados experimentais está sujeita às disposições do Decreto-Lei n.º 129/92, de 6 de Julho, sua regulamentação e sucessivas alterações, relativo à protecção dos animais para fins experimentais.

1.7 Aplicação dos critérios do guia:

A classificação deve abranger as propriedades toxicológicas e físico-químicas das substâncias e preparações e, para além disso, as propriedades ecotoxicológicas das substâncias.

A classificação das substâncias e preparações é feita com base nos critérios dos capítulos 2 a 4 e, no caso das substâncias, no capítulo 5 do presente anexo. Devem ser tidos em conta todos os tipos de perigos. Por exemplo, a classificação de acordo com o ponto 3.2.1 não implica que parágrafos como o 3.2.2 ou 3.2.4 possam ser ignorados.

A escolha do(s) símbolo(s) e da(s) frase(s) indicadora(s) de risco é feita com base na classificação, de modo a garantir que a natureza dos perigos potenciais identificados na classificação se encontre expressa no rótulo.

Não obstante os critérios definidos nos pontos 2.2.3, 2.2.4 e 2.2.5, as substâncias e preparações na forma de aerossóis estão sujeitas aos critérios de inflamabilidade especificados no Decreto-Lei n.º 108/92, de 2 de Junho, regulamentado pela Portaria n.º 778/92, de 10 de Agosto, na sua actual redacção.

1.7.1 Definições:

Por «substâncias» entendem-se os elementos químicos e seus compostos no estado natural ou tal como são obtidos por qualquer processo de produção, incluindo qualquer aditivo necessário para preservar a estabilidade do produto e qualquer impureza proveniente do processo de produção, mas excluindo qualquer solvente que possa ser separado sem afectar a estabilidade da substância nem modificar a sua composição.

Uma substância pode ser quimicamente muito bem definida (por exemplo, a acetona) ou ser uma mistura complexa de componentes de composições variáveis (por exemplo, os destilados aromáticos). No caso de algumas substâncias complexas, já foram identificados alguns dos seus componentes individuais.

Por «preparações» entendem-se as misturas ou soluções constituídas por duas ou mais substâncias.

1.7.2 Aplicação dos critérios do guia às substâncias:

Os critérios orientadores definidos no presente anexo são directamente aplicáveis sempre que os dados em questão tenham sido obtidos por métodos de ensaio comparáveis aos descritos no anexo V. Nos outros casos, os dados disponíveis devem ser avaliados por comparação dos métodos de ensaio utilizados com os indicados no anexo V e com as regras especificadas no presente anexo para a determinação da classificação e da rotulagem adequadas.

Em determinados casos poderão surgir dúvidas quanto à aplicação dos critérios relevantes, em especial sempre que estes últimos necessitem da apreciação de peritos. Em tais casos, o produtor, o distribuidor ou o importador devem classificar e rotular provisoriamente a substância com base na avaliação dos dados disponíveis por uma pessoa competente.

Sem prejuízo do n.º 2 do artigo 18.º, nos casos em que, na sequência da aplicação do procedimento supra, subsistam preocupações sobre possíveis incoerências, deve apresentar-se uma proposta de inclusão da classificação provisória no anexo I. A proposta deve ser apresentada a um Estado membro e ser acompanhada de dados científicos adequados (v. também o ponto 4.1).

Pode adoptar-se um procedimento análogo sempre que existam informações que suscitem dúvidas quanto à adequação de uma entrada incluída no anexo I.

1.7.2.1 Classificação de substâncias que contenham impurezas, aditivos ou componentes individuais:

Quando tenham sido identificados impurezas, aditivos ou componentes individuais de substâncias, tais impurezas, aditivos ou componentes individuais deverão ser tidos em conta se os limites de concentração forem iguais ou excederem os limites a seguir especificados:

• 0,1%, para as substâncias classificadas como muito tóxicas, tóxicas, carcinogénicas (categoria 1 ou 2), mutagénicas (categoria 1 ou 2) ou tóxicas para a reprodução (categoria 1 ou 2);

• 1%, para as substâncias classificadas de nocivas, corrosivas, irritantes, sensibilizantes, carcinogénicas (categoria 3), mutagénicas (categoria 3) ou tóxicas para a reprodução (categoria 3);

salvo se o anexo I do presente Regulamento especificar valores inferiores.

Com excepção das substâncias especificamente enumeradas no anexo I, a classificação, no que se refere às propriedades físico-químicas e aos perigos para a saúde, deve ser efectuada em conformidade com o disposto no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho; quanto à rotulagem, deve ser efectuada em conformidade com o disposto na mesma legislação.

A classificação em relação às propriedades físico-químicas é efectuada de acordo com os critérios do capítulo 2 e em relação aos efeitos perigosos para o ambiente e efectuada em conformidade com os critérios do capítulo 5 do presente anexo.

No caso do amianto (650-013-00-6), esta regra geral não se aplica até que um limite de concentração seja fixado no anexo I. As substâncias que contêm amianto devem ser classificadas e rotuladas em conformidade com os princípios definidos nos artigos 17.º a 20.º do presente Regulamento.

1.7.3 Aplicação dos critérios do guia às preparações:

Os critérios orientadores definidos no presente anexo são directamente aplicáveis sempre que os dados em questão tenham sido obtidos por métodos de ensaio comparáveis aos descritos no anexo V, com excepção dos critérios definidos no capítulo 4, aos quais apenas é aplicável o método convencional. Nos outros casos, os dados disponíveis devem ser avaliados, comparando os métodos de ensaio utilizados com os indicados no anexo V e com as regras especificadas no presente anexo, para determinação da classificação e rotulagem adequadas.

Se os riscos para a saúde forem avaliados por aplicação do método convencional referido no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho, os limites de concentração individuais aplicáveis são os especificados:

• no anexo I do presente Regulamento;

• ou no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho, no caso de a substância ou substâncias não figurarem no anexo I do presente Regulamento, ou nele figurem sem limites de concentração.

No caso das preparações que contêm misturas de gases, a classificação relativa aos efeitos na saúde será estabelecida pelo método de cálculo, com base nos limites de concentração individuais que figuram no anexo I, ou, se esses limites não figurarem no anexo I, com base nos critérios do Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho.

1.7.3.1 Preparações ou substâncias descritas no ponto 1.7.2.1 utilizadas como componentes de outras preparações:

A rotulagem destas preparações deve obedecer às disposições do artigo 7.º e cumprir as condições previstas no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho. Contudo, em alguns casos, as informações dadas no rótulo da preparação ou substância descrita no parágrafo 1.7.2.1 são insuficientes para permitir que outros produtores, que pretendam utilizá-las como constituintes da sua ou suas preparações, efectuem a classificação e rotulagem correctas dessa ou dessas preparações. Nesses casos, a pessoa estabelecida na Comunidade e responsável pela colocação da preparação ou substância original, descrita no parágrafo 1.7.2.1, no mercado, quer seja o produtor, o importador ou o distribuidor, deverá fornecer, o mais rapidamente possível, mediante pedido justificado, todos os dados necessários relativos às substâncias perigosas presentes, de modo a permitir a correcta classificação e rotulagem da nova preparação. Esses dados também são necessários para que a pessoa responsável pela colocação da nova preparação no mercado possa cumprir os outros requisitos da presente legislação.

2 Classificação com base nas propriedades físico-químicas

2.1 Introdução:

Os métodos de ensaio relativos às propriedades explosivas, comburentes e de inflamabilidade incluídos no anexo V do presente Regulamento têm por fim dar um significado específico às definições gerais apresentadas nas alíneas a) a e) do artigo 3.º do presente Regulamento. Os critérios advêm directamente dos métodos de ensaio do anexo V, quando mencionados.

Se se dispuser de informações adequadas que indiquem que, na prática, as propriedades físico-químicas das substâncias e preparações (exceptuam-se os peróxidos orgânicos) são diferentes das reveladas pelos métodos de ensaio do anexo V, essas substâncias e preparações deverão ser classificadas de acordo com os eventuais perigos que representem para as pessoas que as manipulem ou para outras pessoas.

2.2 Critérios para a classificação, escolha de símbolos e indicações de perigo e escolha de frases indicadoras de riscos:

No caso das preparações, haverá que ter em conta os critérios referidos no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho.

2.2.1 Explosivo:

As substâncias e preparações serão classificadas como explosivas e caracterizadas pelo símbolo «E» e pela indicação de perigo «explosivo» em função dos resultados dos ensaios referidos no anexo V e desde que sejam explosivas na forma em que são colocadas no mercado. É obrigatória uma frase indicadora de risco, atribuída de acordo com os critérios a seguir definidos:

R2 Risco de explosão por choque, fricção, fogo ou outras fontes de ignição:

• substâncias e preparações, salvo as excepções a seguir indicadas.

R3 Grande risco de explosão por choque, fricção, fogo ou outras fontes de ignição:

• as substâncias e preparações particularmente sensíveis, tais como os sais do ácido pícrico ou o PETN.

2.2.2 Comburente:

As substâncias e preparações serão classificadas como comburentes e caracterizadas pelo símbolo «O» e pela indicação de perigo «comburente» em função dos resultados dos ensaios referidos no anexo V. É obrigatória uma frase indicadora de risco, atribuída com base nos resultados dos ensaios em função dos seguintes critérios:

R7 Pode provocar incêndio:

• peróxidos orgânicos que apresentam propriedades inflamáveis mesmo quando não estão em contacto com outros materiais combustíveis.

R8 Favorece a inflamação de matérias combustíveis:

• outras substâncias e preparações oxidantes, incluindo os peróxidos inorgânicos, que possam provocar incêndios ou aumentar o risco de incêndio quando em contacto com matérias combustíveis.

R9 Pode explodir quando misturado com matérias combustíveis:

• outras substâncias e preparações, incluindo os peróxidos inorgânicos, que se tornem explosivas quando misturadas com matérias combustíveis, por exemplo, certos cloratos.

2.2.2.1 Observações relativas aos peróxidos:

No que respeita às propriedades explosivas, os peróxidos orgânicos e suas preparações, na forma em que são colocados no mercado, são classificados de acordo com os critérios estabelecidos no ponto 2.2.1, c-om base em ensaios efectuados em conformidade com os métodos que se apresentam no anexo V. No que se refere às propriedades oxidantes, os métodos do anexo V não são aplicáveis aos peróxidos orgânicos.

Quanto às substâncias, os peróxidos orgânicos ainda não classificados como explosivos são classificados como perigosos com base na respectiva estrutura (por exemplo, R-O-O-H; R(índice 1)-O-O-R(índice 2)).

As preparações ainda não classificadas de explosivas devem ser classificadas através do método de cálculo baseado na percentagem de oxigénio activo descrito no ponto 9.5.

Os peróxidos orgânicos e suas preparações ainda não classificados de explosivos são classificados de explosivos se contiverem:

• mais de 5% de peróxidos orgânicos; ou

• mais de 0,5% de oxigénio disponível dos peróxidos orgânicos e mais de 5% de peróxidos de hidrogénio.

2.2.3 Extremamente inflamável:

As substâncias e preparações serão classificadas como extremamente inflamáveis e caracterizadas pelo símbolo «F+» e pela indicação de perigo «extremamente inflamável» em função dos resultados dos ensaios referidos no anexo V. As frases indicadoras de risco serão atribuídas de acordo com os critérios a seguir definidos:

R12 Extremamente inflamável:

• as substâncias e preparações líquidas cujo ponto de inflamação seja inferior a 0ºC e cuja temperatura de ebulição (ou, no caso de um intervalo de ebulição, a temperatura de início da ebulição) não exceda 35ºC;

• as substâncias e preparações gasosas inflamáveis em contacto com o ar à temperatura e pressão normais.

2.2.4 Facilmente inflamável:

As substâncias e preparações serão classificadas como facilmente inflamáveis e caracterizadas pelo símbolo «F» e pela indicação de perigo «facilmente inflamável» em função dos resultados dos ensaios referidos no anexo V. As frases indicadoras de risco serão atribuídas de acordo com os critérios a seguir definidos:

R11 Facilmente inflamável

• as substâncias e preparações sólidas que possam inflamar-se facilmente por breve contacto com uma fonte de ignição e que continuam a arder ou a ser consumidas depois do afastamento dessa fonte;

• as substâncias e preparações líquidas cujo ponto de inflamação seja inferior a 21ºC mas que não sejam extremamente inflamáveis.

R15 Em contacto com a água liberta gases extremamente inflamáveis:

• as substâncias e preparações que, em contacto com a água ou com ar húmido, libertem gases extremamente inflamáveis em quantidades perigosas (no mínimo, 1 l/kg/h).

R17 Espontaneamente inflamável ao ar:

• as substâncias e preparações que possam aquecer e, finalmente, inflamar-se em contacto com o ar à temperatura ambiente, sem qualquer fornecimento de energia.

2.2.5 Inflamável:

As substâncias e preparações serão classificadas como inflamáveis em função dos resultados dos ensaios referidos no anexo V. A frase indicadora de risco será atribuída de acordo com os critérios a seguir definidos:

R10 Inflamável:

• as substâncias e preparações líquidas cujo ponto de inflamação seja igual ou superior a 21ºC e inferior ou igual a 55ºC.

No entanto, foi demonstrado na prática que não é necessário classificar de inflamável uma preparação com ponto de inflamação igual ou superior a 21ºC e inferior ou igual a 55ºC, se essa preparação não puder, de nenhuma forma, manter a combustão e, nesse caso, apenas se não envolver qualquer risco para as pessoas que a manipulem ou para outras pessoas.

2.2.6 Outras propriedades físico-químicas:

Às substâncias e preparações classificadas em conformidade com os parágrafos 2.2.1 a 2.2.5 precedentes ou com os capítulos 3, 4 e 5 subsequentes serão atribuídas outras frases indicadoras de risco, de acordo com os critérios a seguir definidos (baseados na experiência adquirida durante a elaboração do anexo I):

R1 Explosivo no estado seco:

• as substâncias e preparações explosivas colocadas no mercado em solução ou numa forma húmida, tais como a nitrocelulose com mais de 12,6% de azoto.

R4 Forma compostos metálicos explosivos muito sensíveis:

• as substâncias e preparações que possam formar derivados metálicos explosivos sensíveis, tais como o ácido pícrico e o ácido estífnico.

R5 Perigo de explosão sob a acção do calor:

• as substâncias e preparações termicamente instáveis não classificadas como explosivas, tais como o ácido perclórico de concentração superior a 50%.

R6 Perigo de explosão com ou sem contacto com o ar:

• as substâncias e preparações instáveis à temperatura ambiente, tais como o acetileno.

R7 Pode provocar incêndio:

• as substâncias e preparações reactivas, tais como o flúor e o hidrossulfito de sódio.

R14 Reage violentamente em contacto com a água:

• as substâncias e preparações que reajam violentamente com a água, tais como o cloreto de acetilo, os metais alcalinos e o tetracloreto de titânio.

R16 Explosivo quando misturado com substâncias comburentes:

• as substâncias e preparações que reajam de forma explosiva com agentes oxidantes, tais como o fósforo vermelho.

R18 Pode formar mistura vapor-ar explosiva/inflamável durante a utilização:

• as preparações que, não sendo classificadas como inflamáveis, contenham componentes voláteis inflamáveis em contacto com o ar.

Rl9 Pode formar peróxidos explosivos:

• as substâncias e preparações que possam formar peróxidos explosivos durante o armazenamento, tais como o éter etílico e o 1,4 -dioxano.

R30 Pode-se tornar facilmente inflamável durante o uso:

• as preparações que, não sendo classificadas como inflamáveis, possam tornar-se inflamáveis por perda de componentes voláteis não inflamáveis.

R44 Risco de explosão se aquecido em ambiente fechado:

• substâncias e preparações que, não sendo classificadas como explosivas em conformidade com o ponto 2.2.1, possam, na prática, apresentar propriedades explosivas quando aquecidas num ambiente demasiado fechado. É o caso, por exemplo, de determinadas substâncias que, quando aquecidas num recipiente de aço, se decompõem de forma explosiva mas que não apresentam essa característica quando aquecidas em recipientes menos resistentes.

Para outras frases indicadoras de risco v. o parágrafo 3.2.7.

3 Classificação com base em propriedades toxicológicas

3.1 Introdução:

3.1.1 A classificação está associada aos efeitos agudo e a longo prazo das substâncias e preparações, quer resultem de uma única exposição quer de uma exposição repetida ou prolongada.

Se tiver sido convenientemente demonstrado que, na prática, o efeito tóxico das substâncias e das preparações nos seres humanos é, ou pode ser, diferente do efeito previsto a partir dos resultados experimentais obtidos em animais ou por aplicação do método convencional referido no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho, essas substâncias e preparações deverão ser classificadas de acordo com a sua toxicidade nos seres humanos. Contudo, os ensaios em seres humanos devem ser desaconselhados e, normalmente, não deverão ser utilizados para contradizer dados positivos obtidos em animais.

3.1.2 A classificação das substâncias deve ser efectuada com base nos dados experimentais disponíveis e de acordo com os critérios seguintes, que têm em conta a amplitude desses efeitos:

3.1.3 No caso das preparações, a classificação relativa aos perigos para a saúde efectua-se do modo seguinte:

• quer no anexo I do presente Regulamento:

• quer no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho, sempre que a substância ou substâncias não figurarem no anexo I do presente Regulamento ou nele figurem mas sem limites de concentração;

Qualquer que seja o método utilizado para a avaliação dos riscos de uma preparação, deve-se atender a todos os efeitos perigosos para a saúde que são definidos no Decreto-Lei n.º 120/92, de 30 de Junho, na redacção que lhe foi dada pela Portaria n.º 1152/97, de 12 de Novembro, e pelo Decreto-Lei n.º 189/99, de 2 de Junho.

3.1.4 Sempre que a classificação seja estabelecida com base em resultados experimentais obtidos em ensaios com animais, esses resultados deverão ter validade para os seres humanos, reflectindo os riscos de modo adequado.

3.1.5 A toxicidade aguda por via oral das substâncias ou preparações colocadas no mercado pode ser estabelecida quer por um método que permita a determinação do valor DL(índice 50) quer através da determinação da dose discriminante (pelo método da dose fixa).

A dose discriminante é a dose que provoca toxicidade evidente sem causar mortalidade e deverá ser um dos quatro níveis de dosagem especificados no anexo V (5, 50, 500 ou 2000 mg/kg de massa corporal).

O conceito de «toxicidade evidente» corresponde a efeitos tóxicos, decorrentes da exposição à substância testada, tão intensos que a exposição à dose fixa superior causará, provavelmente, mortalidade.

Os resultados do teste de uma determinada dose poderão ser:

• menos de 100% de sobreviventes;

• 100% de sobreviventes, embora com toxicidade evidente;

• 100% de sobreviventes sem toxicidade evidente.

O método utilizado exige, em alguns casos, que sejam testadas doses inferiores ou superiores, caso o nível apropriado não tenha ainda sido testado. Também deve ser referido o quadro de avaliação do método de ensaio B.1 bis anexo V.

Nos critérios dos parágrafos 3.2.1, 3.2.2 e 3.2.3 apenas se apresenta o resultado final dos testes. A dose de 2000 mg/kg deve ser testada em primeiro lugar quando se pretenda obter informações sobre os efeitos tóxicos das substâncias de baixa toxicidade aguda e que não sejam classificadas com base em toxicidade aguda.

3.2 Critérios para a classificação, escolha de símbolos e indicações de perigo e escolha de frases indicadoras de riscos:

3.2.1 Muito tóxico:

As substâncias e preparações serão classificadas como muito tóxicas e caracterizadas pelo símbolo «T+» e pela indicação de perigo «muito tóxico» de acordo com os critérios a seguir especificados.

As frases indicadoras de risco serão atribuídas de acordo com os seguintes critérios:

R28 Muito tóxico por ingestão:

Resultados de toxicidade aguda:

• DL(índice 50) por via oral, no rato =<25 mg/kg;

• menos de 100% de sobreviventes, a 5 mg/kg, por via oral, no rato utilizando o método da dose fixa.

R27 Muito tóxico em contacto com a pele:

Resultados de toxicidade aguda:

• DL(índice 50) por via cutânea, no rato ou no coelho: =<50 mg/kg.

R26 Muito tóxico por inalação:

Resultados de toxicidade aguda:

• CL(índice 50) por inalação, no rato, para aerossóis ou partículas: =<0,25 mg/litro/4h;

• CL(índice 50) por inalação, no rato, por gases e vapores: =<0,5 mg/litro/4h.

R39 Perigo de efeitos irreversíveis muito graves:

• no caso de existirem elementos concludentes quanto à possibilidade da danos irreversíveis, diferentes dos efeitos referidos no capítulo 4, através de uma única exposição por uma via adequada, geralmente na gama de doses acima referida.

Para indicar a via de administração/exposição, deve ser utilizada uma das seguintes combinações: R39/26, R39/27, R39/28, R39/26/27, R39/26/28, R39/27/28, R39/26/27/28.

3.2.2 Tóxico:

As substâncias e preparações devem ser classificadas como tóxicas, e caracterizadas pelo símbolo «T» e a indicação de perigo «tóxico», de acordo com os critérios a seguir especificados. As frases indicadoras de risco serão atribuídas de acordo com os critérios a seguir definidos:

R25 Tóxico por ingestão:

Resultados de toxicidade aguda:

• DL(índice 50) por via oral, no rato: 25
• dose discriminante, 5 mg/kg, por via oral, no rato: 100% de sobreviventes, mas apresentando toxicidade evidente. R24 Tóxico em contacto com a pele: Resultados de toxicidade aguda:
• DL(índice 50) por via cutânea, no rato ou no coelho: 50 R23 Tóxico por inalação: Resultados de toxicidade aguda:
• CL(índice 50) por inalação, no rato, para aerossóis e partículas: 0,25
• CL(índice 50) por inalação, no rato, para gases e vapores: 0,5 R39 Perigo de efeitos irreversíveis muito graves:
• no caso de existirem elementos concludentes quanto à possibilidade de danos irreversíveis, diferentes dos efeitos referidos no capítulo 4, através de uma única exposição por uma via adequada, geralmente na gama de doses acima referida. Para indicar a via de administração/exposição, deve ser utilizada uma das seguintes combinações: R39/23, R39/24, R39/25, R39/23/24, R39/23/25, R39/24/25, R39/23/24/25. R48 Risco de efeitos graves para a saúde em caso de exposição prolongada:
• no caso de efeitos graves (perturbações funcionais ou alterações morfológicas evidentes de origem toxicológica) que possam ser causados por exposição repetida ou prolongada por uma via adequada. As substâncias e as preparações serão classificadas pelo menos como «tóxicas» sempre que estes efeitos sejam observados a níveis inferiores, numa ordem de grandeza (isto é, 10 vezes), aos níveis estabelecidos para a R48 no parágrafo 3.2.3. Para indicar a via de administração/exposição, deve ser utilizada uma das seguintes combinações: R48/23, R48/24, R48/25, R48/23/24, R48/23/25, R48/24/25, R48/23/24/25. 3.2.3 Substâncias nocivas: As substâncias e preparações devem ser classificadas de nocivas, sendo-lhes atribuído o símbolo «Xn» e a indicação de perigo «nocivo», em conformidade com os critérios a seguir especificados. As frases indicadoras de risco serão atribuídas de acordo com os seguintes critérios: R22 Nocivo por ingestão: Resultados de toxicidade aguda:
• DL(índice 50) por via oral, no rato: 200
• dose discriminante, por via oral, no rato, 50 mg/kg: 100% de sobrevivência, mas efeitos tóxicos evidentes;
• sobrevivência inferior a 100% a 50 mg/kg, no rato, por via oral, através do procedimento de dosagem fixa. Ver o quadro de avaliação do método de ensaio B.1, a), do anexo V. R21 Nocivo em contacto com a pele: Resultados de toxicidade aguda:
• DL(índice 50) por contacto com a pele, no rato ou no coelho: 400 R20 Nocivo por inalação: Resultados de toxicidade aguda:
• CL(índice 50) por inalação, no rato, para aerossóis e partículas: 1
• CL(índice 50) por inalação, no rato, para gases e vapores: 2 R65 Nocivo: pode causar danos nos pulmões se ingerido: Substâncias e preparações líquidas que apresentem para o homem um risco de aspiração em virtude da sua baixa viscosidade, ou seja: