Decreto-Lei n.º 27-A/2006 — Altera o Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de…

Análise de relações estrutura actividade (SAR) (etapa 2). Devem ser considerados os resultados de ensaios de substâncias químicas estruturalmente semelhantes desde que se encontrem disponíveis. No caso de existirem dados suficientes sobre humanos e/ou animais relativos aos efeitos de substâncias estruturalmente semelhantes, ou misturas deste tipo de substâncias, indicativos do seu potencial de irritação/corrosão dérmica, pode presumir se que a substância de ensaio em avaliação produzirá as mesmas respostas. Nestes casos, poderá não ser necessário proceder a ensaios da substância de ensaio. Os dados negativos obtidos de estudos de substâncias estruturalmente semelhantes ou misturas dessas substâncias não constituem prova suficiente de não-corrosibilidade/não-irritabilidade da substância segundo a estratégia de ensaio sequencial. Devem ser utilizadas abordagens de SAR validadas e aceites para identificação do potencial de irritação e de corrosão dérmica.

Propriedades físico-químicas e reactividade química (etapa 3). As substâncias que apresentam um pH extremo, tal como (igual ou menor que) 2,0 ou (igual ou maior que) 11,5, podem ter efeitos locais fortes. Se o pH extremo servir como base de identificação da substância como corrosiva para a pele, a sua reserva ácida/alcalina (ou poder tampão) deve ser também tida em consideração (3)(4). Se o poder tampão indicar que a substância pode não ser corrosiva para a pele, devem ser efectuados ensaios adicionais para confirmar esta indicação, de preferência utilizando ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites (ver etapas 5 e 6).

Toxicidade dérmica (etapa 4). Caso se tenha provado que uma substância química é muito tóxica por via dérmica, pode não ser exequível um estudo in vivo de irritação/corrosão dérmica por a quantidade de substância de ensaio normalmente aplicada poder exceder a dose muito tóxica, resultando consequentemente na morte ou em sofrimento grave dos animais. Além disso, pode não ser necessário efectuar ensaios dérmicos de irritação/corrosão adicionais quando os estudos de toxicidade dérmica utilizando coelhos albinos tenham sido efectuados até um nível de dosagem limite de 2000 mg/kg de peso corporal ou superior e não tenha sido observada qualquer irritação ou corrosão dérmica. Deve ter-se em conta uma série de considerações aquando da avaliação da toxicidade dérmica aguda em estudos efectuados anteriormente. Por exemplo, a informação contida no relatório sobre lesões dérmicas pode estar incompleta. Os ensaios e as observações podem ter sido efectuados noutra espécie que não o coelho, podendo as várias espécies diferir grandemente na sensibilidade das respostas apresentadas. A forma como a substância de ensaio foi aplicada aos animais pode não ter sido adequada à avaliação da irritação/corrosão da pele (por exemplo, diluição das substâncias para ensaio da toxicidade dérmica (5)). No entanto, nos casos em que os estudos de toxicidade dérmica em coelhos foram projectados e efectuados correctamente, os resultados negativos podem ser considerados prova suficiente de que a substância não é irritante nem corrosiva.

Resultados de ensaios in vitro ou ex vivo (etapas 5 e 6). Não é necessário proceder a ensaios em animais com substâncias que tenham apresentado propriedades corrosivas ou de irritação grave num ensaio in vitro ou ex vivo validado e aceite (6)(7) que tenha sido desenvolvido para avaliar especificamente estes efeitos. Pode considerar-se que tais substâncias produzirão efeitos graves semelhantes in vivo.

Ensaio in vivo em coelhos (etapas 7 e 8): Caso seja tomada a decisão de efectuar um ensaio in vivo com base numa análise da importância das provas, este deve começar por um ensaio inicial usando um animal. Se os resultados deste ensaio indicarem que a substância é corrosiva para a pele, não devem ser efectuados outros ensaios. Se o ensaio inicial não revelar quaisquer efeitos corrosivos, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando até dois animais adicionais com um período de exposição de quatro horas. No caso de se observar um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmação deve ser efectuado de uma forma sequencial ou através da exposição de dois animais adicionais simultaneamente.

REFERÊNCIAS

(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp. 19-26.

(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli e Howard I. Maibach (organizadores): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6,

(6) Método de Ensaio B.40.

(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. e Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524.

FIGURA 1:

ESTRATÉGIA DE ENSAIO E AVALIAÇÃO PARA IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICA

(ver figura no documento original)

ANEXO VIII — "B. 5. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO OCULAR

O presente método baseia-se na publicação OECD TG 405 (2002) (normas de ensaio da OCDE).

1.1 INTRODUÇÃO

Na preparação do presente método optimizado foi dada especial importância aos possíveis melhoramentos resultantes da avaliação de toda a informação já existente sobre a substância de ensaio, de modo a evitar ensaios desnecessários em animais de laboratório e assim ter em consideração a problemática da protecção dos animais. O presente método inclui a recomendação de se efectuar uma análise da importância das provas (1) dos dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio in vivo descrito para irritação/corrosão ocular aguda. No caso de não se encontrarem disponíveis dados suficientes, recomenda-se a obtenção desses dados através da aplicação de ensaios sequenciais (2) (3). A estratégia de ensaio recomendada inclui a execução de ensaios in vitro validados e aceites e é fornecida na Parte 1 do método de ensaio. Além disso, recomenda-se o uso de um ensaio in vivo de irritação/corrosão dérmica para previsão da corrosão ocular antes de se considerar um ensaio ocular in vivo.

Tendo em consideração o interesse científico e a protecção dos animais, não devem ser considerados ensaios in vivo até se proceder a uma avaliação de todos os dados disponíveis relevantes à potencial corrosibilidade/capacidade irritante ocular de uma substância para uma análise da importância das provas. Os dados devem incluir provas de estudos existentes em humanos e/ou animais de laboratório, provas de corrosibilidade/capacidade irritante de uma ou mais substâncias estruturalmente relacionadas, ou de misturas dessas substâncias, dados que demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substância (4)(5) e resultados de ensaios in vitro ou ex vivo, validados e aceites, para corrosão e irritação da pele (6)(6a). Estes estudos podem ter sido efectuados previamente ou como resultado de uma análise de importância das provas.

Uma análise deste tipo pode indicar, para algumas substâncias, a necessidade de estudos in vivo do potencial de irritação/corrosão ocular da substância. Em todos estes casos, antes de considerar a utilização de um ensaio ocular in vivo, deve efectuar-se preferencialmente um estudo in vivo prévio sobre os efeitos dérmicos da substância, avaliados de acordo com o método de ensaio B.4 (7). A aplicação de uma análise de importância das provas e a estratégia de ensaio sequencial deverão reduzir a necessidade de ensaios in vivo para a corrosibilidade/capacidade irritante ocular de substâncias para as quais existem suficientes provas prévias de outros estudos. Caso a determinação do potencial de corrosão ou irritação ocular não possa ser efectuada utilizando a estratégia de ensaio sequencial, mesmo após a realização de um estudo in vivo da corrosão e irritação dérmica, pode ser efectuado um ensaio in vivo de irritação/corrosão ocular.

Junta-se na Parte 1 do presente método de ensaio uma estratégia de ensaio sequencial preferível, que inclui a execução de ensaios validados in vitro ou ex vivo para irritação/corrosão. A estratégia foi desenvolvida num grupo de trabalho (workshop) da OCDE (8), no qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo sido adoptada como estratégia de ensaio recomendada pelo sistema harmonizado a nível mundial para a classificação de substâncias químicas (GHS) (9). Recomenda-se que a estratégia de ensaio sequen-cial seja adoptada antes de realizar ensaios in vivo. No caso de substâncias novas, recomenda-se uma metodologia de ensaio por etapas para a obtenção de dados científicos sobre a corrosibilidade/capacidade irritante da substância. No caso de substâncias já existentes mas cujos dados sobre irritação/corrosão dérmica e ocular são insuficientes, recomenda-se a adopção desta estratégia para a obtenção dos dados em falta. Caso se opte por uma estratégia ou protocolo de ensaio diferente ou se decida não aplicar uma metodologia de ensaio por etapas, deverá apresentar-se uma justificação fundamentada.

1.2 DEFINIÇÕES

Irritação ocular: consiste na produção de alterações oculares após a aplicação de uma substância de ensaio à superfície anterior do olho, alterações essas que são completamente reversíveis no intervalo de 21 dias após a aplicação.

Corrosão ocular: consiste na produção de lesões do tecido ocular ou enfraquecimento físico grave da visão após aplicação da substância de ensaio à superfície anterior do olho, não reversíveis no intervalo de 21 dias após a aplicação.

1.3 PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

A substância de ensaio é aplicada em dose única a um dos olhos do animal de experiência; o olho que não sofre tratamento é utilizado como controlo. O grau de irritação/corrosão ocular é avaliado pelas lesões de perfuração da conjuntiva, da córnea e da íris, a intervalos determinados. São também descritos outros efeitos sobre o olho e efeitos sistémicos adversos, de modo a permitir uma avaliação completa dos efeitos. A duração do estudo deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos.

Os animais que apresentem sinais continuados de se encontrarem em grave perigo e/ou apresentarem sinais de dor durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e a substância deve ser classificada de acordo com estas observações. Os critérios para a decisão de abater animais moribundos e animais em grave sofrimento podem ser consultados na referência (10).

1.4 DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.1 Preparação para o ensaio in vivo

1.4.1.1 Selecção de espécies

O coelho albino é o animal de laboratório mais adequado, devendo ser usados animais adultos, jovens e saudáveis. A utilização de outras estirpes ou espécies deve ser justificada.

1.4.1.2 Preparação dos animais

Devem examinar-se ambos os olhos do animal seleccionado provisoriamente para o ensaio, 24 horas antes do início do ensaio. Não devem ser usados animais que apresentem irritação ocular, defeitos oculares ou lesão pré-existente da córnea.

1.4.1.3 Condições de alojamento e alimentação

Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotério para os coelhos deve ser de 20ºC ((mais ou menos) 3ºC). A humidade relativa deve ser no mínimo de 30% e, preferivelmente, não exceder 70%, excepto durante a lavagem do biotério, devendo no entanto manter-se idealmente a valores de 50-60%. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Como alimentação, podem ser utilizadas dietas de laboratório convencionais com fornecimento ilimitado de água para beber.

1.4.2 Protocolo de ensaio

1.4.2.1 Aplicação da substância de ensaio

A substância de ensaio deve ser colocada no saco conjuntival de um dos olhos de cada animal, depois de ter separado cuidadosamente a pálpebra inferior do globo ocular. Fecham-se as pálpebras cuidadosamente durante cerca de um segundo de modo a evitar a perda de material. O outro olho, que permanece sem tratamento, é utilizado como controlo.

1.4.2.2 Irrigação

Os olhos dos animais de ensaio não devem ser lavados pelo menos nas 24 horas seguintes à instilação da substância de ensaio, excepto para o caso de sólidos (consultar a secção 1.4.2.3.2) e no caso de ocorrência imediata de efeitos corrosivos ou irritantes. Após 24 horas, desde que se considere apropriada, pode ser efectuada uma lavagem.

Não se recomenda a utilização de um grupo satélite de animais para investigar a influência da lavagem, excepto se tal se justificar cientificamente. Se for necessário um grupo satélite de animais, devem utilizar-se dois coelhos. As condições de lavagem devem ser cuidadosamente documentadas, por exemplo, data e hora da lavagem; composição e temperatura da solução de lavagem; duração, volume e velocidade de aplicação.

1.4.2.3 Nível de dosagem

1.4.2.3.1 Ensaio de líquidos

No caso do ensaio de líquidos, usa-se uma dose de 0,1 ml. Não devem ser utilizados nebulizadores de bomba para instilação directa da substância no olho. O nebulizado líquido deve ser expelido e recolhido num recipiente antes de se instilar 0,1 ml no olho.

1.4.2.3.2 Ensaio de sólidos

No caso de ensaio de substâncias sólidas, pastas ou substâncias em partículas, a quantidade usada deve ter um volume de 0,1 ml ou uma massa não superior a 100 mg. O material de ensaio deve ser pulverizado a um pó fino. O volume de material sólido deve ser medido após compactação suave, por exemplo, através de batidas do recipiente que o contém. Se ao tempo da primeira observação, 1 hora após o tratamento, a substância de ensaio sólida não tiver sido removida do olho do animal de ensaio através de mecanismos fisiológicos, o olho pode ser lavado com soro fisiológico ou água destilada.

1.4.2.3.3 Ensaio de aerossóis

Recomenda-se a recolha do conteúdo de todos os nebulizadores de bomba e aerossóis antes de instilação no olho. A única excepção é para substâncias em recipientes de aerossol pressurizados, que não podem ser recolhidos devido à sua vaporização. Nestes casos, deve manter-se o olho aberto e administrar-se a substância de ensaio no olho numa aplicação única de duração aproximada de um segundo, mantendo o recipiente directamente à frente do olho a uma distância de 10 cm. Esta distância pode variar em função da pressão do nebulizador e do seu conteúdo. Devem ser tomadas precauções adequadas para não danificar o olho devido à pressão do nebulizador. Em casos apropriados, pode ser necessário avaliar o potencial de lesão "mecânica" do olho pela força da nebulização.

Pode obter-se uma estimativa da dose de um aerossol através de simulação do ensaio da seguinte forma: nebuliza-se a substância para um papel de pesagem através de uma abertura do tamanho do olho de coelho, colocada directamente em frente do papel. Utiliza-se o aumento de peso do papel como uma aproximação da quantidade nebulizada para o olho. Para substâncias voláteis, a dose pode ser estimada por pesagem do recipiente de recolha antes e após a remoção do material de ensaio.

1.4.2.4 Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritação/corrosão ocular utilizando um animal)

Tal como articulado na estratégia de ensaio sequencial (ver Parte 1), recomenda-se vivamente que o ensaio in vivo seja efectuado inicialmente utilizando um animal.

Se, utilizando o protocolo descrito, os resultados deste ensaio indicarem que a substância é corrosiva ou fortemente irritante para o olho, não devem ser efectuados outros ensaios de irritação ocular.

1.4.2.5 Anestesia local

A utilização de anestesia local pode ser feita, mas analisando a sua necessidade caso a caso. Se a análise de importância das provas indicare que a substância pode causar dor ou se os ensaios iniciais revelarem ocorrência de reacção dolorosa, pode utilizar-se um anestésico local antes da instilação da substância de ensaio. A selecção do tipo, concentração e dose de anestésico local deve ser feita cuidadosamente de modo a assegurar que a sua utilização não altere a reacção à substância de ensaio. O olho de controlo deve ser anestesiado de igual forma.

1.4.2.6 Ensaio de confirmação (ensaio in vivo de irritação ocular com animais adicionais)

Se não for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando até dois animais adicionais. Se for observado no ensaio inicial um efeito francamente irritante, indicativo de um efeito possivelmente forte (irreversível) no ensaio de confirmação, recomenda-se que se efectue o ensaio de confirmação de uma forma sequencial num animal de cada vez, em vez de expor dois animais adicionais simultaneamente. Se o segundo animal apresentar efeitos corrosivos ou fortemente irritantes, não se deve continuar o ensaio. Pode ser necessária a utilização de animais adicionais para confirmar respostas de irritação fracas ou moderadas.

1.4.2.7 Período de observação

A duração do período de observação deve ser suficiente para uma avaliação completa da magnitude e reversibilidade dos efeitos observados. No entanto, a experiência deve ser interrompida em qualquer altura se o animal apresentar sintomas continuados de dor intensa ou de se encontrar em situação de perigo (9). Para a determinação da reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser examinados normalmente durante 21 dias após a administração da substância de ensaio. No caso de se observar reversibilidade antes do fim do período de 21 dias, deve interromper-se a experiência.

1.4.2.7.1 Observações clínicas e graduação das reacções oculares

Os olhos devem ser examinados 1, 24, 48 e 72 horas após a aplicação da substância de ensaio. Os animais só devem ser mantidos sob ensaio durante o tempo necessário para obter informação definitiva. Os animais que apresentem sintomas continuados de dor intensa ou de perigo devem ser abatidos sem demora, sendo a substância classificada de acordo com estes resultados. Os animais que apresentem as seguintes lesões oculares posteriores à instilação devem ser abatidos: perfuração da córnea; ulceração significativa da córnea, incluindo estafiloma; sangue na câmara anterior do olho; opacidade da córnea de grau 4 persistente durante 48 horas; ausência de reflexo à luz (resposta da íris de grau 2) persistente durante 72 horas; ulceração da membrana conjuntival; necrose da conjuntiva ou da membrana nictitante; ou formação de crosta. Este procedimento é devido ao facto de normalmente este tipo de lesões ser irreversível.

Os ensaios com animais que não desenvolvam lesões oculares podem ser interrompidos, mas não antes de 3 dias após a instilação. Os animais que apresentem lesões fracas a moderadas devem permanecer sob observação até cura de todas as lesões ou durante o período de 21 dias, após o qual o estudo é finalizado.

As observações devem ser efectuadas 7, 14 e 21 dias após a aplicação de modo a determinar o estado das lesões e a sua reversibilidade ou irreversibilidade.

Os graus da reacção ocular (conjuntiva, córnea e íris) devem ser anotados em cada exame (Tabela 1). Quaisquer outras lesões do olho (por exemplo, pannus da córnea, coloração) ou efeitos sistémicos adversos devem igualmente ser incluídos no relatório.

O exame das reacções pode ser facilitado pela utilização de uma lupa binocular, de uma lâmpada de fenda manual, de um biomicroscópio ou de outro instrumento apropriado. Após anotação das observações no final de 24 horas, o exame aos olhos pode ser feito recorrendo a fluoresceína.

A graduação das respostas oculares é necessariamente subjectiva. O pessoal que executa as observações deve ser treinado adequadamente no sistema de graduação utilizado para promover a harmonização da graduação da resposta ocular e auxiliar os laboratórios de ensaio e as pessoas envolvidas na obtenção e interpretação das observações.

2.2 ANÁLISE DOS RESULTADOS

Os resultados de irritação ocular devem ser avaliados conjuntamente com a natureza e gravidade das lesões e a sua reversibilidade ou ausência de reversibilidade. As respostas individuais não representam um padrão absoluto das propriedades irritantes do material, já que são também avaliados outros efeitos do material de ensaio. Pelo contrário, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referência que só são significativos quando corroborados por uma descrição e avaliação completas de todas as observações.

3.1 RELATÓRIO DO ENSAIO

O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:

Fundamentação lógica para o ensaio in vivo: análise de importância das provas dos dados de ensaio pré-existentes, incluindo os resultados da estratégia de ensaio sequencial:

• descrição dos dados relevantes disponíveis de ensaios anteriores;

• dados obtidos em cada etapa da estratégia de ensaio;

• descrição dos ensaios in vitro efectuados, incluindo detalhes sobre o protocolo, resultados obtidos com substâncias de ensaio/referência;

• descrição do estudo efectuado in vivo sobre irritação/corrosão dérmica, incluindo os resultados obtidos;

• análise de importância das provas para a realização do estudo in vivo

Substância de ensaio:

• dados de identificação (por exemplo, número CAS, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas, número de lote);

• natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, pH, volatilidade, solubilidade, estabilidade, reactividade com água);

• no caso de misturas, composição e percentagens relativas dos componentes;

• no caso de utilização de um anestésico local, identificação, grau de pureza, tipo, dose e interacção potencial com a substância de ensaio.

Excipiente:

• identificação, concentração (quando apropriado), volume utilizado;

• justificação para a escolha do excipiente.

Animais de ensaio:

• espécie/estirpe utilizada, fundamentação lógica para a utilização de outro tipo de animais que não coelhos albinos;

• idade de cada animal no início do estudo;

• número de animais de cada sexo no ensaio e nos grupos de controlo (se necessário);

• peso individual dos animais no início e no final do ensaio;

• origem, condições de alojamento, dieta, etc.

Resultados:

• descrição do método utilizado para medir a irritação em cada observação (por exemplo, lâmpada de fenda manual, biomicroscópio, fluoresceína);

• disposição em tabelas dos dados sobre a resposta irritante/corrosiva para cada animal em cada observação até remoção do animal do ensaio;

• descrição pormenorizada do grau e natureza da irritação ou corrosão observadas;

• descrição de quaisquer outras lesões do olho observadas (por exemplo, vascularização, formação de pannus da córnea, adesões, coloração);

• descrição de efeitos não-oculares locais e efeitos sistémicos adversos e, caso sejam efectuadas, das observações histopatológicas.

3.2 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

A extrapolação dos resultados dos estudos de irritação ocular em animais de laboratório para humanos tem uma validade limitada. Em muitos casos, o coelho albino é mais sensível do que os humanos a substâncias irritantes ou corrosivas oculares.

A interpretação dos dados deve ser feita cuidadosamente de modo a excluir irritação resultante de infecções secundárias.

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.

(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.

(3) Worth A.P. e Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. e Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524.

(6a) Método de Ensaio B.40 para Corrosão da Pele.

(7) Método de Ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritação/corrosão dérmica.

(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 -24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

TABELA 1: GRADUAÇÃO DE LESÕES OCULARES

Córnea

Opacidade: grau de densidade (as medições devem ser efectuadas na área mais densa)(ver nota *)

Sem ulceração nem opacidade ... 0

Áreas de opacidade escassas ou difusas (para além de uma pequena perda do lustre normal); detalhes da íris claramente visíveis ... 1

Área translúcida claramente discernível; detalhes da íris ligeiramente obscurecidos ... 2

Área nacarada; não são visíveis os detalhes da íris; o tamanho da pupila é dificilmente discernível ... 3

Córnea opaca; a íris não é discernível através da opacidade ... 4

Máximo possível: 4

(nota *) Deve ser anotada qual a área de opacidade da córnea

Íris

Normal ... 0

Rugas marcadamente profundas, congestão, tumefacção, hiperemia ao redor da córnea moderada; ou injecção; íris reactiva à luz (considera-se que uma reacção lenta é um efeito) ... 1

Hemorragia, destruição maciça ou ausência de reacção à luz ... 2

Máximo possível: 2

Conjuntiva

Vermelhidão (refere-se à conjuntiva palpebral e bulbar; excluindo a córnea e a íris)

Normal ... 0

Alguns vasos sanguíneos com hiperemia (injectados) ... 1

Cor carmesim difusa; vasos individuais não são claramente discerníveis ... 2

Cor vermelho-carne difusa ... 3

Máximo possível: ... 3

Quimiose

Tumefacção (refere-se às pálpebras e/ou às membranas nictantes)

Normal ... 0

Alguma tumefacção acima do normal ... 1

Tumefacção óbvia, com eversão parcial das pálpebras ... 2

Tumefacção, com as pálpebras semi-cerradas ... 3

Tumefacção, com as pálpebras mais do que semi-cerradas ... 4

Máximo possível: 4

PARTE 1 — Uma Estratégia de Ensaio Sequencial para a Irritação e Corrosão Ocular

CONSIDERAÇÕES GERAIS

No sentido de atender aos interesses quer científicos, quer da protecção dos animais, torna-se importante evitar o uso desnecessário de animais e minimizar os ensaios que possam causar reacções graves em animais. Deve ser analisada toda a informação sobre a substância que seja relevante para a sua potencial capacidade irritante/corrosibilidade ocular antes de se considerarem os ensaios in vivo. É possível que existam já dados suficientes para classificar a substância de ensaio segundo o seu potencial irritante ou corrosivo ocular, sem necessidade de recorrer a ensaios em animais de laboratório. Assim, a utilização de uma análise de importância das provas e de uma estratégia de ensaio sequencial minimizará a necessidade de ensaios in vivo, especialmente no caso de substâncias susceptíveis de produzir reacções graves.

Recomenda-se a utilização da análise de importância das provas para avaliar a informação existente sobre irritação e corrosão ocular e determinar a necessidade de se efectuar estudos adicionais, diferentes dos estudos oculares in vivo, que sejam úteis para caracterizar o referido potencial. No caso de serem necessários estudos adicionais, recomenda-se a utilização de uma estratégia de ensaio sequencial para a obtenção dos dados experimentais relevantes. No caso de substâncias para as quais não exista nenhuma história de ensaios, deve ser utilizada a estratégia sequencial para a obtenção dos dados necessários para avaliar a sua irritação/corrosão ocular. A estratégia de ensaio descrita na presente Parte foi desenvolvida num grupo de trabalho (workshop) da OCDE (1). Foi subsequentemente confirmado e ampliado no sistema harmonizado e integrado de classificação de perigos para a saúde humana e efeitos ambientais de substâncias químicas, tal como foi aprovado pela 28ª sessão conjunta do comité das substâncias químicas e do grupo de trabalho de substâncias químicas, em Novembro de 1998 (2).

Apesar da presente estratégia de ensaio não fazer parte integrante do método de ensaio B.5, ela expressa a metodologia recomendada para a determinação das propriedades de irritação/corrosão ocular. Esta metodologia representa não só a melhor prática como também um ponto de referência ético para o ensaio in vivo para irritação/corrosão ocular. O método de ensaio fornece uma orientação para a realização do ensaio in vivo e resume os factores que devem ser considerados antes de ponderar a execução deste ensaio. A estratégia de ensaio sequencial fornece uma metodologia de análise da importância das provas para a avaliação dos dados existentes sobre as propriedades de irritação/corrosão ocular de substâncias e uma metodologia em séries para a obtenção de dados relevantes sobre substâncias para as quais sejam necessários estudos adicionais ou para os quais não tenham sido efectuados quaisquer estudos. A estratégia inclui inicialmente a realização de ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites e, seguidamente, do método de ensaio B.4 para o estudo de irritação/corrosão dérmica em circunstâncias específicas (3)(4).

DESCRIÇÃO DA ESTRATÉGIA DE ENSAIO POR ETAPAS

Antes da realização dos ensaios como parte da estratégia de ensaio sequencial (Figura 1), deve ser avaliada toda a informação disponível de modo a determinar a necessidade de realização de ensaios oculares in vivo. Apesar de ser possível obter informação significativa a partir da avaliação de um só parâmetro (por exemplo, pH extremo), deve ser avaliada a totalidade da informação existente. Para uma decisão baseada na análise da importância das provas, devem ser avaliados todos os dados relevantes sobre os efeitos da substância em causa, bem como dos seus análogos estruturais, e deve apresentar-se uma justificação fundamentada para a decisão tomada. Deve dar-se especial relevância aos dados existentes sobre a substância relativamente a humanos e animais e, seguidamente, aos resultados dos ensaios in vitro ou ex vivo. Sempre que possível devem ser evitados estudos in vivo de substâncias corrosivas. Os factores considerados na estratégia de ensaio incluem:

Avaliação dos dados existentes sobre humanos e animais (etapa 1). Devem considerar-se em primeiro lugar os dados existentes sobre humanos - por exemplo, estudos clínicos e ocupacionais, relatórios de casos clínicos e/ou dados de ensaios de estudos oculares em animais -, já que estes dados fornecem informação directamente relacionada com os efeitos nos olhos. Em seguida, devem ser avaliados os dados disponíveis sobre estudos de investigação da irritação/corrosão dérmica em humanos e/ou animais. As substâncias que apresentem evidências de corrosibilidade ou capacidade irritante grave para os olhos conhecidas não devem ser instiladas em olhos de animais. De igual forma, as substâncias que apresentam efeitos corrosivos ou irritantes para a pele, também não devem ser instiladas em olhos de animais, devendo ser consideradas igualmente corrosivas e/ou irritantes para os olhos. As substâncias que apresentem provas suficientes de não serem corrosivas ou irritantes em estudos oculares efectuados anteriormente também não devem ser ensaiadas em estudos oculares in vivo.

Análise de relações estrutura-actividade (SAR) (etapa 2). Devem ser considerados os resultados de ensaios de substâncias químicas estruturalmente semelhantes, caso se encontrem disponíveis. No caso de existirem dados sobre humanos e/ou animais suficientes, relativos aos efeitos de substâncias estruturalmente semelhantes ou a misturas deste tipo de substâncias, indicativos do seu potencial de irritação/corrosão ocular, pode presumir-se que a substância de ensaio produzirá as mesmas reacções. Nestes casos, poderá não ser necessário proceder a ensaios da substância. Os dados negativos obtidos de estudos de substâncias estruturalmente semelhantes ou misturas dessas substâncias não constituem prova suficiente de não-corrosibilidade/não-irritabilidade da substância sob estratégia de ensaio sequencial. Devem ser utilizadas abordagens de SAR validadas e aceites para identificação do potencial de irritação e corrosão tanto dos efeitos dérmicos como oculares.

Propriedades físico-químicas e reactividade química (etapa 3). As substâncias que apresentam pH extremos tais como (igual ou menor que) 2,0 ou (igual ou maior que) 11,5, podem ter efeitos locais fortes. Se o pH extremo servir como base de identificação da corrosibilidade ou capacidade irritante ocular de uma substância, a sua reserva ácida/alcalina (poder tampão) também deve ser tida em consideração (5)(6). Se o poder tampão indicar que a substância pode não ser corrosiva para o olho, devem ser efec-tuados ensaios adicionais para confirmar esta indicação, de preferência utilizando ensaios in vitro ou ex vivo validados e aceites (ver secção das etapas 5 e 6).

Consideração de outras informações existentes (etapa 4). Nesta etapa, deve ser avaliada toda a informação disponível sobre toxicidade sistémica por via dérmica. Deve ser também considerada a toxicidade dérmica aguda da substância de ensaio. Se tiver sido demonstrado que a substância é muito tóxica por via dérmica pode não ser necessário efectuar ensaios oculares. Apesar de não existir necessariamente uma relação entre a toxicidade dérmica aguda e a irritação/corrosão ocular, pode considerar-se que se um agente é muito tóxico por via dérmica também mostrará elevada toxicidade quando instilado no olho. Estes dados podem ser também considerados entre as Etapas 2 e 3.

Resultados de ensaios in vitro ou ex vivo (etapas 5 e 6). Não é necessário proceder a ensaios em animais de substâncias que tenham apresentado propriedades corrosivas ou de irritação grave em ensaios in vitro ou ex vivo (7)(8) que tenham sido validados e aceites para estimar especificamente a corrosibilidade/capacidade de irritação ocular ou dérmica. Pode considerar-se que estas substâncias produzirão efeitos graves semelhantes in vivo. Se não se encontrarem disponíveis ensaios in vitro/ex vivo validados e aceites, devem ultrapassar-se as Etapas 5 e 6 e passar-se directamente à Etapa 7.

Avaliação da capacidade irritante ou corrosibilidade dérmica in vivo de uma substância (etapa 7). Caso não existam dados suficientes para uma análise da importância das provas conclusiva sobre o potencial de irritação/corrosão de uma substância baseada nos dados dos estudos supramencionados, deve proceder-se em primeiro lugar a uma avaliação do potencial de irritação/corrosão dérmica in vivo, utilizando o método de ensaio B.4 (4) e a sua Parte 1 (9). Se a substância causar corrosão ou irritação grave da pele, deve ser considerada um irritante ocular corrosivo, excepto se existir outro tipo de informação que apoie uma conclusão alternativa. Assim, não há necessidade de efectuar um ensaio ocular in vivo. Se a substância não for corrosiva ou gravemente irritante para a pele, deve efectuar-se um ensaio ocular in vivo.

Ensaio in vivo em coelhos (Etapas 8 e 9). O ensaio ocular in vivo deve começar por um ensaio inicial usando um animal. Se os resultados deste ensaio indicarem que a substância provoca irritação grave ou é corrosiva para os olhos, não devem ser efectuados outros ensaios. Se o ensaio não revelar quaisquer efeitos corrosivos ou de irritação grave, deve efectuar-se um ensaio de confirmação com dois animais adicionais.

REFERÊNCIAS

(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3) Worth, A.P. e Fentem J.H. (1999) A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.

(4) Método de ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritação/corrosão dérmica.

(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.

(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.

(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. e Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483-524.

(8) Método de Ensaio B.40. Corrosão Dérmica.

(9) Parte 1 do método de ensaio B.4: Uma Estratégia de Ensaio Sequencial para Irritação e Corrosão Dérmicas.

FIGURA 1

ESTRATÉGIA DE ENSAIO E AVALIAÇÃO PARA IRRITAÇÃO/CORROSÃO OCULAR

(ver figura no documento original)

ANEXO IX — "B.31. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE O DESENVOLVIMENTO PRÉ-NATAL

O presente método baseia-se na publicação OECD TG 414 (2001) (normas de ensaio da OCDE).

1.1 INTRODUÇÃO

O presente método de ensaio de toxicidade sobre o desenvolvimento destina-se a fornecer informação geral sobre os efeitos de exposição pré-natal no animal de ensaio prenhe e no organismo em desenvolvimento no útero; pode incluir a avaliação de efeitos maternos e de morte, anomalias estruturais ou alterações no crescimento do feto. Apesar de constituírem uma parte importante do desenvolvimento, as deficiências funcionais não são contempladas neste método de ensaio, poderão ser testadas num estudo independente ou em complementaridade ao presente estudo, usando o método de ensaio de neurotoxicidade sobre o desenvolvimento. Para obter informações relativas aos ensaios sobre deficiências funcionais e outros efeitos pós-natais, deverão consultar-se os métodos de ensaio para o estudo da toxicidade sobre a reprodução em duas gerações e o estudo da neurotoxicidade sobre o desenvolvimento, conforme seja apropriado.

Em situações pontuais, poderá revelar-se oportuno introduzir adaptações específicas no método de ensaio com base em informações relativas, por exemplo, às propriedades físico-químicas ou toxicológicas da substância de ensaio. Contudo, este procedimento só será aceitável quando existirem fortes razões científicas de que as alterações ao método conduzirão a um ensaio mais informativo. Nesse caso, os fundamentos científicos que justificam as adaptações introduzidas deverão ser cuidadosamente documentados no relatório do estudo.

1.2 DEFINIÇÕES

Toxicologia sobre o desenvolvimento: estudo dos efeitos adversos que se manifestam num organismo em desenvolvimento em resultado da exposição a determinada substância antes da concepção, durante o desenvolvimento pré-natal ou no período que decorre desde o nascimento até à maturação sexual. As principais manifestações de toxicidade sobre desenvolvimento incluem: 1) morte do organismo, 2) anomalia estrutural, 3) alterações no crescimento e 4) deficiência funcional. Anteriormente, a toxicologia sobre o desenvolvimento era em muitos casos designada por teratologia.

Efeito adverso: qualquer alteração à normalidade relacionada com o tratamento que diminua a capacidade de um organismo para sobreviver, reproduzir-se ou adaptar-se ao meio ambiente. No que respeita à toxicologia sobre o desenvolvimento, esta definição abrange, no seu sentido mais lato, todos os efeitos que interfiram no desenvolvimento normal do concepto, antes e após o nascimento.

Alterações no crescimento: alteração de peso ou tamanho do corpo ou de um órgão de um descendente.

Alterações (anomalias): alterações estruturais no desenvolvimento, que incluem as malformações e as variações (28).

Malformação/Anomalia Grave: alteração estrutural considerada prejudicial para o animal (pode também ser letal), cuja ocorrência é normalmente rara.

Variação/Anomalia Ligeira: alteração estrutural pouco ou nada prejudicial para o animal; pode ser transiente e ocorrer com relativa frequência na população de controlo.

Concepto: conjunto dos derivados de um óvulo fertilizado em qualquer estádio de desenvolvimento, desde a fertilização até ao nascimento, incluindo as membranas extra-embrionárias, bem como o embrião ou o feto.

Implantação (nidação): ligação do blastocisto ao revestimento epitelial do útero, incluindo a sua penetração através do epitélio uterino e a sua implantação no endométrio.

Embrião: estádio inicial ou em desenvolvimento de qualquer organismo; mais especificamente, é o produto da fertilização de um óvulo nas fases de desenvolvimento que decorrem desde o aparecimento da corda dorsal até à formação de todas as estruturas principais.

Embriotoxicidade: conjunto dos efeitos prejudiciais sobre a estrutura, desenvolvimento, crescimento e/ou viabilidade normais de um embrião.

Feto: organismo em gestação no período pós-embrionário.

Toxicidade fetal: conjunto dos efeitos prejudiciais sobre a estrutura, desenvolvimento, crescimento e/ou viabilidade normais de um feto.

Aborto: expulsão prematura do útero dos produtos da concepção: o embrião ou um feto inviável.

Reabsorção: reabsorção (presente ou passada) de um produto de concepção morto depois de implantado no útero.

Reabsorção prematura: sinais de implantação sem existência reconhecível de embrião/feto.

Reabsorção tardia: embrião ou feto morto, que apresentam alterações degenerativas externas.

NSEAO: abreviatura para nível sem efeito adverso observável; corresponde à maior dose ou ao maior nível de exposição para o qual não se observam efeitos adversos relacionados com o tratamento.

1.3 SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA

Nenhuma.

1.4 PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

Normalmente, a substância de ensaio é administrada aos animais prenhes desde o momento da implantação (pelo menos) até ao dia anterior ao previsto para o sacrifício. O dia do sacrifício deverá ser agendado o mais próximo possível da data esperada para o parto, sem que seja descurada a possibilidade de ocorrerem parto prematuro e a consequente perda de dados. O método de ensaio não se destina apenas a examinar o período da organogénese (por exemplo, dias 5-15 em roedores e dias 6-18 no coelho); permite também avaliar efeitos de toxicidade desde a pré-implantação (se apropriado) e ao longo de todo o período de gestação até ao dia anterior à operação cesariana. As fêmeas são sacrificadas pouco antes da operação cesariana, após o que os conteúdos uterinos são examinados e os fetos inspeccionados para detectar a presença de anomalias externas visíveis e alterações dos tecidos moles e do esqueleto.

1.5 DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.5.1 Selecção de espécies animais

Recomenda-se que o ensaio seja realizado com as espécies mais relevantes e que se utilizem as espécies e estirpes laboratoriais mais vulgarmente usadas em ensaios de toxicidade sobre o desenvolvimento pré-natal. As espécies preferidas para ensaio são o rato, no caso de roedores, e o coelho, no caso de não-roedores. O uso de outras espécies deverá ser devidamente justificado.

1.5.2 Condições de alojamento e alimentação

A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 22ºC ((mais ou menos) 3º) para roedores e 18ºC ((mais ou menos) 3º) para coelhos. A humidade relativa deverá ser 50-60%, embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30% e um máximo que, preferivelmente, não deverá exceder 70%, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. O acasalamento deve ocorrer em gaiolas adequadas para o efeito. Embora seja preferível alojar individualmente os animais durante o acasalamento, considera-se aceitável o alojamento conjunto de um pequeno número de animais.

1.5.3 Preparação dos animais

Devem usar-se animais saudáveis que tenham permanecido nas condições laboratoriais durante pelo menos 5 dias antes do ensaio para aclimatação e que não tenham sido sujeitos a experiências anteriores. Os animais de ensaio devem ser caracterizados no que respeita à espécie, estirpe, proveniência, sexo, peso e/ou idade. Os animais de todos os grupos de ensaio devem ser, tanto quanto possível, uniformes quanto ao peso e à idade. Devem usar-se fêmeas jovens, adultas e nulíparas em todos os níveis de dose. As fêmeas devem acasalar com machos da mesma espécie e estirpe, devendo evitar-se o acasalamento entre irmãos. Em roedores, considera-se o dia 0 de gestação aquele em que se observa um rolhão vaginal e/ou esperma. Em coelhos, o dia 0 é normalmente o dia do coito ou da inseminação artificial, caso esta técnica seja usada. As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Cada animal deve receber um número de identificação individualizado. As fêmeas acasaladas devem ser distribuídas pelos grupos de controlo e de tratamento de forma aleatória. Caso tenha havido alojamento conjunto de várias fêmeas durante o acasalamento, os animais de cada conjunto devem ser distribuídos uniformemente pelos grupos de ensaio. Do mesmo modo, as fêmeas inseminadas pelo mesmo macho devem ser distribuídas equitativamente pelos vários grupos.

1.6 PROCEDIMENTO

1.6.1 Número e sexo dos animais

Cada grupo de ensaio e de controlo deve comportar um número de fêmeas suficiente para que se obtenham cerca de 20 animais com locais de implantação no momento da necropsia. Os grupos com menos de 16 animais com locais de implantação poderão ser considerados como inadequados. A mortalidade materna não invalida necessariamente o estudo, desde que não seja superior a cerca de 10%.

1.6.2 Preparação das doses

Se for usado um agente de transporte ou outro aditivo para facilitar a administração das doses, deverão ser tomadas em consideração as seguintes características: efeitos na absorção, distribuição, metabolismo e retenção ou excreção da substância de ensaio; efeitos nas propriedades químicas da substância de ensaio susceptíveis de alterar as suas características tóxicas; e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutricional dos animais. O agente de transporte não deverá apresentar toxicidade sobre o desenvolvimento nem exercer efeitos na reprodução.

1.6.3 Dosagem

Normalmente, a substância de ensaio deverá ser administrada diariamente, desde a implantação (por exemplo, no dia 5 pós-acasalamento) até ao dia anterior ao previsto para a operação cesariana. Se estudos anteriores eventualmente disponíveis não indicarem um elevado potencial para perdas pré-implantação, o tratamento poderá prolongar-se de forma a abranger todo o período de gestação, desde o acasalamento até ao dia anterior ao previsto para o sacrifício. É sabido que a manipulação imprópria ou a sujeição a tensões durante a gravidez podem resultar em perdas pré-natais, pelo que devem evitar-se manipulações desnecessárias dos animais prenhes e tensões de origem externa, tais como ruído, de forma a minimizar as perdas por factores não relacionados com o tratamento.

Devem utilizar-se pelo menos três níveis de dose e um controlo simultâneo. Os animais saudáveis devem ser distribuídos aleatoriamente pelos grupos de controlo e de tratamento. Os níveis de dose devem ser espaçados de forma a produzir uma gradação de efeitos tóxicos. A escolha do nível de dose máximo deve ter como objectivo produzir alguma toxicidade sobre o desenvolvimento e/ou sobre a mãe (sinais clínicos ou diminuição do peso corporal), mas não a morte ou sofrimento agudo, salvo se existirem limitações impostas pela natureza físico-química ou pelas propriedades biológicas da substância de ensaio. Pelo menos um dos níveis de dose intermédios deverá produzir efeitos tóxicos mínimos observáveis. O nível de dose mais baixo não deverá induzir qualquer sinal de toxicidade sobre a mãe ou sobre o desenvolvimento. Deve seleccionar-se uma sequência descendente de níveis de dose que permita detectar qualquer resposta relacionada com a dosagem e determinar o nível sem efeito adverso observável (NSEAO). Frequentemente, a melhor forma de estabelecer estas sequências consiste no espaçamento das doses em série geométrica, usando factores de dois ou de quatro. A adição de um quarto grupo de ensaio é muitas vezes preferível ao uso de intervalos muito grandes entre as dosagens (ou seja, com um factor superior a 10). Embora um dos objectivos do ensaio seja a determinação do NSEAO materno, podem considerar-se aceitáveis estudos que não permitam o cálculo deste valor (1).

A escolha dos níveis de dose deverá tomar em consideração todos os dados de toxicidade existentes, bem como informações adicionais sobre o metabolismo e toxicocinética da substância de ensaio ou de substâncias relacionadas. Estas informações poderão ser também usadas para demonstrar a adequação do regime de dosagem.

Deve usar-se um grupo de controlo simultâneo, que poderá ser um grupo com tratamento simulado ou, se for usado um agente de transporte para administrar a substância de ensaio, um grupo de controlo do agente de transporte. Todos os grupos devem ser tratados com o mesmo volume da substância de ensaio ou do agente de transporte. Os animais do(s) grupo(s) de controlo devem ser manipulados de forma idêntica aos animais dos grupos de ensaio. Os grupos de controlo do agente de transporte deverão receber o volume máximo de agente de transporte utilizado no ensaio (ou seja, um volume idêntico ao do grupo do nível de dose mais baixo).

1.6.4 Ensaio-limite

Se um ensaio com um nível de dose oral de pelo menos 1000 mg/kg de peso corporal/dia, realizado de acordo com os procedimentos descritos neste estudo, não provocar toxicidade observável nos animais prenhes nem na sua descendência e se, para além disso, os dados existentes sobre compostos estrutural e/ou metabolicamente relacionados com a substância de ensaio não sugerirem a possível ocorrência de efeitos, poderá considerar-se desnecessário realizar um ensaio completo com três níveis de dose. Nos casos em que se preveja exposição humana, poderá ser necessário aumentar o nível de dose oral no ensaio-limite.

Quando se usam outras formas de administração, como inalação ou aplicação cutânea, as propriedades físico-químicas da substância de ensaio são muitas vezes indicativas e limitantes do nível máximo de exposição praticável (por exemplo, a aplicação cutânea não deverá causar toxicidade local grave).

1.6.5 Administração das doses

Na maior parte dos casos, a substância de ensaio ou o agente de transporte são administrados oralmente por intubação. Se for usada outra via de administração, o experimentador deverá indicar e justificar as razões que presidiram à sua escolha; nesse caso, poderá ser necessário introduzir modificações apropriadas no método de ensaio (2)(3)(4). A substância de ensaio deve ser administrada todos os dias aproximadamente à mesma hora.

Normalmente, a dose a administrar a cada animal é calculada com base na determinação mais recente do seu peso corporal. No entanto, o ajuste das doses durante o último terço da gravidez deve ser feito com precaução. A escolha da dose deve tomar em consideração dados de estudos anteriores para evitar um excesso de toxicidade materna; contudo, se tal suceder, as mães com indícios de toxicidade excessiva devem ser sacrificadas. Se vários animais prenhes apresentarem sinais de excesso de toxicidade, deverá considerar-se a possibilidade de pôr termo ao grupo de dose a que pertencem. A administração por gavagem deve ser feita, de preferência, numa toma única, usando uma sonda gástrica ou uma cânula de intubação apropriada.

O volume máximo de líquido que pode ser administrado numa toma depende do tamanho do animal de ensaio, não devendo exceder 1 ml/100 g de peso corporal; exceptuam-se as soluções aquosas, que podem ser administradas na proporção de 2 ml/100 g de peso corporal. Quando se usa óleo de milho como agente de transporte, o volume máximo aceitável é de 0,4 ml/100 g de peso corporal. Deve minimizar-se a variabilidade do volume de ensaio efectuando ajustes nas concentrações, de forma a assegurar a constância do volume em todos os níveis de dose.

1.6.6 Observação das mães

Devem efectuar-se observações clínicas pelo menos uma vez por dia, de preferência sempre à(s) mesma(s) hora(s). A escolha do momento da observação deve tomar em consideração o período de efeitos máximos previsto que se verifica após a administração da dose. Estas observações devem ser descritas num registo, que deverá conter indicações sobre a condição dos animais, incluindo mortalidade, estado moribundo, alterações pertinentes do comportamento e todos os sinais de manifesta toxicidade.

1.6.7 Peso corporal e consumo de alimento

Os animais devem ser pesados no dia 0 de gestação (se os animais acasalados forem fornecidos por um criador externo, a pesagem poderá ser feita até ao dia 3 de gestação, o mais tardar), no primeiro dia de dosagem, de três em três dias (pelo menos) durante o período de dosagem e no dia do sacrifício.

Devem efectuar-se registos do consumo de alimento de três em três dias, coincidindo com dias da determinação do peso corporal.

1.6.8 Inspecção pós-morte

As fêmeas devem ser sacrificadas no dia anterior ao previsto para o parto. As fêmeas que apresentem sinais de aborto ou parto prematuro antes da data marcada para o sacrifício deverão ser mortas antecipadamente e submetidas a um exame macroscópico completo.

No momento do sacrifício ou da morte durante o estudo, as mães serão objecto de um exame macroscópico, a fim de se detectarem quaisquer anomalias estruturais ou modificações patológicas. A observação das mães durante a operação de cesariana e a subsequente análise fetal deverão ser feitas de preferência sem que os restantes animais do grupo se apercebam para evitar perturbações.

1.6.9 Exame dos conteúdos uterinos

Imediatamente após o sacrifício ou o mais cedo possível depois da morte espontânea, os úteros serão retirados para se averiguar o estado de gravidez dos animais. Os úteros que não se apresentem grávidos devem ser submetidos a exames adicionais (por exemplo, coloração com sulfureto de amónio em roedores e coloração de Salewsky ou um método alternativo apropriado em coelhos) para confirmar o estado de não-gravidez (5).

Devem pesar-se os úteros grávidos, incluindo o colo. Não serão considerados para pesagem os úteros grávidos provenientes de animais encontrados mortos durante o estudo.

Deve determinar-se o número de corpos amarelos nos animais prenhes.

Devem examinar-se os conteúdos uterinos para determinar os números de embriões ou de fetos mortos, bem como o número de fetos viáveis. Deve avaliar-se o grau de reabsorção, a fim de determinar o tempo relativo da morte do concepto (ver secção 1.2).

1.6.10 Exame dos fetos

Devem determinar-se o sexo e o peso corporal de cada feto.

Cada feto será objecto de um exame para detectar alterações externas (6).

Os fetos devem ser examinados para detectar alterações do esqueleto e dos tecidos moles (por exemplo, variações e malformações ou anomalias) (7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24). É aconselhável (mas não obrigatório) proceder à categorização das alterações fetais, explicitando claramente os critérios usados para definir cada categoria. O aparelho reprodutor deve ser objecto de especial atenção, devendo ser inspeccionado quanto a sinais de alterações no desenvolvimento.

No caso de roedores, devem preparar-se e examinar-se cerca de metade dos animais de cada ninhada para detecção de alterações do esqueleto; os restantes animais serão preparados e examinados para determinar alterações dos tecidos moles, usando métodos aprovados de seccionamento em série ou técnicas adequadas de dissecação macroscópica cuidadosa.

No caso de não-roedores (por exemplo, o coelho), todos os fetos serão examinados para detectar alterações dos tecidos moles e do esqueleto. Os corpos serão preparados por dissecação cuidadosa e examinados quanto à existência de alterações dos tecidos moles; o exame pode incluir procedimentos adicionais para avaliação da estrutura cardíaca interna (25). Metade dos fetos será decapitada e as cabeças removidas serão processadas para avaliação de alterações de tecidos moles (incluindo olhos, cérebro, meatos nasais e língua), usando métodos correntes de seccionamento em série (26) ou outros métodos de sensibilidade idêntica. Os corpos dos fetos decapitados e os restantes fetos intactos serão processados e examinados para se detectarem alterações do esqueleto, recorrendo a métodos idênticos aos descritos para roedores.

2 DADOS

2.1 TRATAMENTO DOS RESULTADOS

Os dados relativos às mães e aos seus descendentes devem ser registados individualmente e resumidos em forma tabular, indicando, para cada grupo de ensaio, o número de animais no início do ensaio, o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou sacrificados por razões humanitárias, o momento de todas as mortes (espontâneas ou provocadas), o número de fêmeas grávidas, o número de animais com sinais de toxicidade, uma descrição dos sinais de toxicidade observados (incluindo o momento do aparecimento, a duração e a intensidade), os tipos de observações embrionárias/fetais e todos os dados relevantes sobre as ninhadas.

Os resultados numéricos devem ser avaliados por um método estatístico apropriado, usando a ninhada como unidade para a análise de dados. Deve usar-se um método estatístico geralmente aceite; a sua escolha deve fazer parte do planeamento do estudo e ser devidamente justificada. Devem também registar-se os dados relativos a animais que não sobreviveram até à data prevista para o sacrifício. Quando apropriado, estes dados poderão ser incluídos nas médias de grupos; contudo, a sua importância e, consequentemente, a sua inclusão ou exclusão em qualquer média de grupo devem ser avaliadas e justificadas caso a caso.

2.2 ANÁLISE DOS RESULTADOS

Os dados recolhidos no Estudo de Toxicidade sobre o Desenvolvimento Pré-Natal deverão ser analisados em termos dos efeitos observados. Esta análise deverá considerar a seguinte informação:

• resultados do ensaio relativos à mãe e ao embrião/feto, incluindo uma avaliação da relação (ou da ausência de relação) entre a exposição dos animais à substância de ensaio e a incidência e a gravidade de todos os efeitos observados;

• critérios usados para a categorização das alterações externas, dos tecidos moles e do esqueleto dos fetos, caso tenha sido feita;

• dados de controlo de estudos anteriores, quando apropriado, a fim de consolidar a interpretação dos resultados do presente estudo;

• números usados no cálculo de todas as percentagens ou índices;

• análise estatística adequada dos resultados do estudo, quando apropriado; deverá incluir informação suficiente sobre o método de análise para que um examinador/estatístico independente possa reavaliar e reconstituir a análise.

No caso de o estudo demonstrar a inexistência de qualquer efeito tóxico, deverá considerar-se a possibilidade de realizar investigações adicionais no sentido de definir a absorção e a biodisponibilidade da substância de ensaio.

2.3 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

A finalidade do estudo de toxicidade sobre o desenvolvimento pré-natal reside na obtenção de informações relativas aos efeitos de exposição repetida a uma substância durante a gravidez tanto nas mães como no desenvolvimento intra-uterino dos seus descendentes. A interpretação dos resultados deve tomar em consideração dados de estudos subcrónicos, de reprodução e toxicocinéticos, entre outros eventualmente disponíveis. O estudo enfatiza de igual modo a toxicidade geral, que pode ser avaliada pela toxicidade sobre a mãe, e a toxicidade sobre o desenvolvimento.

Assim, os resultados obtidos vão permitir estabelecer, até certo ponto, a distinção entre (i) os efeitos sobre o desenvolvimento não associados a toxicidade geral e (ii) os efeitos sobre o desenvolvimento que apenas são induzidos em níveis que também são tóxicos para a mãe (27).

3 RELATÓRIO

RELATÓRIO DO ENSAIO

O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações específicas:

Substância de ensaio:

• natureza física e, quando relevante, propriedades físico-químicas;

• identificação, incluindo o número CAS, caso este seja conhecido ou esteja definido;

• pureza.

Agente de transporte (se apropriado):

• caso o agente de transporte não seja água, uma justificação para a sua escolha.

Animais de ensaio:

• espécie e estirpe usadas;

• número e idade dos animais;

• proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.;

• pesos individuais dos animais no início do ensaio.

Condições de ensaio:

• razões que presidiram à escolha dos diferentes níveis de dose;

• informação pormenorizada sobre a formulação da substância de ensaio/preparação da dieta, concentração atingida, estabilidade e homogeneidade da preparação;

• informação pormenorizada sobre a administração da substância de ensaio;

• conversão da concentração da substância de ensaio na dieta/água de beber (ppm) para a dose real (mg/kg de peso corporal/dia), se aplicável;

• condições ambientais;

• informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da água.

Resultados:

Dados de resposta tóxica materna por dose, incluindo, entre outras informações:

• número de animais no início do ensaio, número de animais sobreviventes, número de animais prenhes, número de animais que abortaram, número de animais com parto prematuro;

• dia da morte no decurso do estudo ou indicação dos animais sobreviventes no termo da experiência;

• os dados relativos a animais que não sobreviveram até à data prevista para o sacrifício devem ser incluídos no relatório, mas não devem ser usados em comparações estatísticas entre grupos;

• dia da observação de cada sinal de anomalia clínica e subsequente evolução dessa anomalia;

• peso corporal, alteração do peso corporal e peso do útero grávido; opcionalmente, alteração do peso corporal corrigida em relação ao peso do útero grávido;

• consumo de alimento e consumo de água (caso este tenha sido medido);

• resultados da necropsia, incluindo o peso uterino;

• deverão indicar-se os valores dos NSEAO para os efeitos maternos e para os efeitos sobre o desenvolvimento.

Desenvolvimento atingido nas ninhadas com implantes em cada nível de dose, incluindo:

• número de corpos amarelos;

• número de implantações, número e percentagem de fetos vivos e mortos e de reabsorções;

• número e percentagem de perdas pré- e pós-implantação.

Desenvolvimento atingido nas ninhadas com fetos vivos em cada nível de dose, incluindo:

• número e percentagem de descendentes vivos;

• proporção entre os sexos;

• peso corporal fetal, de preferência por sexo e nos dois sexos em conjunto;

• malformações externas, dos tecidos moles e do esqueleto, bem como outras alterações relevantes;

• critérios usados na categorização, se apropriado;

• número total e percentagem de fetos e ninhadas que apresentem qualquer alteração externa, dos tecidos moles ou do esqueleto, bem como os tipos e incidências de anomalias individuais e outras alterações relevantes.

Análise dos resultados.

Conclusões.

4 REFERÊNCIAS

(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.

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ANEXO X — "B.35. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUÇÃO EM DUAS GERAÇÕES

O presente método baseia-se na publicação OECD TG 416 (2001) (normas de ensaio da OCDE).

1.1 INTRODUÇÃO

O presente método de ensaio de toxicidade sobre a reprodução em duas gerações destina-se a fornecer informação geral sobre os efeitos de uma substância de ensaio na integridade e no desempenho dos sistemas reprodutores de machos e fêmeas, incluindo a função gonadal, o ciclo do estro, o comportamento de acasalamento, a concepção, a gestação, a parturição, a lactação e o desmame, bem como sobre o crescimento e o desenvolvimento dos descendentes. O estudo pode também dar informações sobre os efeitos da substância de ensaio na morbidade e na mortalidade neonatais e fornecer dados preliminares relativos à toxicidade sobre o desenvolvimento pré-natal e pós-natal, podendo ainda servir de guia para ensaios subsequentes. Além de estudar o crescimento e o desenvolvimento da geração F1, este método de ensaio destina-se também a avaliar a integridade e o desempenho dos sistemas reprodutores dos machos e fêmeas dessa geração, bem como o crescimento e o desenvolvimento da geração F2. Caso seja necessário obter informações suplementares relativas à toxicidade sobre o desenvolvimento e às deficiências de desempenho, o presente protocolo pode ser complementado pela introdução de partes de outros estudos descritos em métodos para avaliar a toxicologia sobre o desenvolvimento e/ou a neurotoxicidade sobre o desenvolvimento, conforme o caso; em alternativa, aqueles tópicos podem ser investigados em estudos independentes, com recurso aos métodos de ensaio adequados.

1.2 PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

A substância de ensaio é administrada em doses graduais a vários grupos de machos e fêmeas. Os machos da geração P devem ser tratados durante o crescimento e durante pelo menos um ciclo espermatogénico completo (cerca de 56 dias no ratinho e 70 dias no rato), de forma a permitir a detecção de quaisquer efeitos nocivos na espermatogénese. Os efeitos sobre os espermatozóides são determinados por uma série de parâmetros (por exemplo, morfologia e mobilidade) e por exame histopatológico detalhado de preparações de tecidos. Caso tenham sido previamente realizados estudos de dose repetida de duração adequada (por exemplo, um estudo de 90 dias) que forneçam dados sobre a espermatogénese, não será necessário incluir os machos da geração P na avaliação. No entanto, recomenda-se que sejam guardadas amostras ou gravações digitais do esperma da geração P para possibilitar uma avaliação posterior. As fêmeas da geração P devem ser tratadas durante o crescimento e durante vários ciclos estrais completos, para permitir a detecção de quaisquer efeitos adversos causados pela substância de ensaio na normalidade do ciclo do estro. A substância de ensaio é administrada aos animais progenitores (P) durante o acasalamento, durante os períodos de gravidez resultantes e até ao desmame da descendência F1. Nesta altura, a substância de ensaio passa a ser administrada aos descendentes F1, que a deverão receber durante o crescimento até à idade adulta, o acasalamento e a produção da geração F2, até ao desmame da geração F2.

Todos os animais devem ser objecto de observações clínicas e exames patológicos para se detectarem sinais de toxicidade, devendo dedicar-se atenção especial aos efeitos sobre a integridade e o desempenho dos sistemas reprodutores masculino e feminino, bem como aos efeitos sobre o crescimento e o desenvolvimento da descendência.

1.3 DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.3.1 Selecção da espécie animal

A espécie preferida para ensaio é o rato. Caso se utilizem outras espécies, será necessário justificar o seu emprego e introduzir no método de ensaio as modificações apropriadas. Deve evitar-se a utilização de estirpes de fecundidade baixa ou em que se verifique frequentemente uma incidência elevada de deficiências de desenvolvimento. No início do estudo, a diferença de peso entre os animais deverá ser mínima, não podendo ultrapassar 20% do peso médio de cada sexo.

1.3.2 Condições de alojamento e alimentação

A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 22ºC ((mais ou menos) 3º). A humidade relativa deverá ser 50-60%, embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30% e um máximo que, preferivelmente, não deverá exceder 70%, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. Quando a substância de ensaio for administrada pela alimentação, a escolha da dieta poderá ser condicionada pela necessidade de assegurar a dosagem adequada.

Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do mesmo sexo. O acasalamento deve ocorrer em gaiolas adequadas para o efeito. Quando houver sinais de cópula, as fêmeas acasaladas devem ser colocadas em gaiolas individuais de parto ou de maternidade. Em alternativa, os ratos acasalados podem ser mantidos em grupos pequenos, separando-se apenas um ou dois dias antes do parto. As fêmeas grávidas próximas do termo devem dispor dos materiais de nidificação apropriados e reconhecidos.

1.3.3 Preparação dos animais

Devem usar-se animais jovens e saudáveis, que tenham permanecido nas condições experimentais durante pelo menos 5 dias antes do ensaio para aclimatação e que não tenham sido sujeitos a experiências anteriores. Os animais de ensaio devem ser caracterizados no que respeita à espécie, estirpe, proveniência, sexo, peso e/ou idade. Devem conhecer-se as relações de parentesco directo entre os animais, de modo a evitar o acasalamento entre irmãos. Os animais devem ser distribuídos ao acaso pelos grupos de controlo e de tratamento (recomenda-se a estratificação por peso corporal). As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Cada animal deve receber um número de identificação individualizado. Estes procedimentos devem ser levados a efeito antes do início da dosagem dos animais da geração P e por ocasião do desmame dos animais da geração F1 seleccionados para acasalamento. Devem manter-se registos da ninhada de origem de todos os animais seleccionados da geração F1. Quando o ensaio envolve pesagem individual das crias ou quaisquer testes de desempenho, as crias devem ser identificadas individualmente o mais cedo possível depois do nascimento.

No início da dosagem, os animais progenitores (P) devem ter cerca de 5 a 9 semanas de idade. Os animais de todos os grupos de ensaio deverão ser, tanto quanto possível, uniformes quanto ao peso e à idade.

1.4 PROCEDIMENTO

1.4.1 Número e sexo dos animais

Cada grupo de ensaio e controlo deve comportar um número de animais suficiente para que se obtenham preferivelmente 20 ou mais fêmeas grávidas de termo ou próximas deste. Nos casos em que se utilizem substâncias que causam efeitos indesejáveis relacionados com o tratamento (por exemplo, esterilidade, toxicidade excessiva na dose mais elevada), poderá não ser possível cumprir este requisito. O objectivo é a obtenção de um número de fêmeas grávidas suficiente para garantir uma avaliação significativa do poten-cial da substância para afectar a fecundidade, a gravidez e o comportamento maternal, bem como o aleitamento, o crescimento e o desenvolvimento da prole F1, desde a concepção até à maturidade, e o desenvolvimento da sua descendência (F2) até ao desmame. Por esse motivo, a impossibilidade de obter o número desejado de animais prenhes (isto é, 20) não invalida necessariamente o estudo e deve ser avaliada caso a caso.

1.4.2 Preparação das doses

Recomenda-se que a substância de ensaio seja administrada oralmente (através da alimentação, na água de beber ou por gavagem), excepto nos casos em que se considere mais apropriado utilizar outra via de administração (por exemplo, aplicação cutânea ou inalação).

Se for necessário, a substância de ensaio pode ser dissolvida ou suspensa num agente de transporte apropriado. Recomenda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização de uma solução/suspensão aquosa; caso tal não seja viável, pode considerar-se o uso de uma solução/emulsão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em última instância, poderá eventualmente recorrer-se ao uso de soluções noutros agentes de transporte. Devem conhecer-se as características tóxicas dos agentes de transporte que não sejam a água. Deve determinar-se a estabilidade da substância de ensaio no agente de transporte.

1.4.3 Dosagem

Devem utilizar-se pelo menos três níveis de dose e um controlo simultâneo. A escolha do nível de dose máximo deve ter como objectivo produzir um efeito tóxico, mas não a morte ou sofrimento forte, salvo se existirem limitações impostas pela natureza físico-química ou pelas propriedades biológicas da substância de ensaio. Normalmente, consideram-se aceitáveis estudos com mortalidade inesperada, desde que a taxa de mortalidade dos animais progenitores (P) seja inferior a cerca de 10%. Deve seleccionar-se uma sequência descendente de níveis de dose que permita detectar qualquer efeito relacionado com a dosagem e determinar o nível sem efeitos adversos observáveis (NSEAO). Em muitos casos, a melhor forma de estabelecer estas sequências consiste no espaçamento das doses em série geométrica, usando factores de dois ou de quatro. A adição de um quarto grupo de ensaio é muitas vezes preferível ao uso de intervalos muito grandes entre as dosagens (ou seja, com um factor superior a 10). Quando a substância de ensaio é administrada na alimentação, o espaçamento entre as doses não deve ser superior a um factor de 3. A escolha dos níveis de dose deverá considerar todos os dados de toxicidade existentes, em especial os resultados de estudos de dose repetida, devendo ainda levar em conta quaisquer informações relativas ao metabolismo e à cinética da substância de ensaio ou de substâncias relacionadas. Estas informações poderão também ser usadas para demonstrar a adequação do regime de dosagem.

O grupo de controlo deve ser um grupo não sujeito a tratamento ou, se for usado um agente de transporte para administrar a substância de ensaio, um grupo de controlo do agente de transporte. Os animais do grupo de controlo devem ser tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de ensaio, com excepção do tratamento com a substância de ensaio. Se for usado um agente de transporte, o grupo de controlo deverá receber o volume máximo de agente de transporte utilizado no ensaio. Se a substância de ensaio for administrada na alimentação e causar uma diminuição da ingestão de alimentos e da sua assimilação, poderá ser necessário utilizar um grupo de controlo negativo (submetido ao mesmo regime alimentar reduzido); em alternativa, poderão usar-se os dados de estudos controlados destinados a avaliar os efeitos da diminuição do consumo de alimento nos parâmetros reprodutores.

Deverão ser tomadas em consideração as seguintes características do agente de transporte e outros aditivos: efeitos na absorção, distribuição, metabolismo ou retenção da substância de ensaio; efeitos nas propriedades químicas da substância de ensaio susceptíveis de alterar as suas características tóxicas; e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutricional dos animais.

1.4.4 Ensaio-limite

Se um estudo com um nível de dose oral de pelo menos 1000 mg/kg de peso corporal/dia (ou uma percentagem equivalente nos alimentos ou na água de beber, caso se recorra a um destes tipos de administração), realizado de acordo com os procedimentos descritos neste estudo, não provocar efeitos tóxicos observáveis nos animais progenitores nem na sua prole e se, para além disso, os dados existentes sobre compostos estrutural e/ou metabolicamente relacionados com a substância de ensaio não sugerirem a possível ocorrência de toxicidade, poderá considerar-se desnecessário realizar um ensaio completo com vários níveis de dose. O ensaio-limite é sempre válido, excepto nos casos em que se preveja exposição humana e em que seja necessário testar um nível de dose oral mais elevado. Quando se usam outras formas de administração, como inalação ou aplicação cutânea, as propriedades físico-químicas da substância de ensaio (por exemplo, a solubilidade) são muitas vezes indicativas e limitantes do nível máximo de exposição praticável.

1.4.5 Administração das doses

Os animais devem ser tratados com a substância de ensaio durante os sete dias da semana. A forma de administração preferida é a via oral (alimentação, água de beber ou gavagem). Se for usada outra via de administração, deverão ser indicadas as razões subjacentes à sua escolha; neste caso, poderá ser necessário introduzir modificações apropriadas no método de ensaio. Deve utilizar-se o mesmo método de administração em todos os animais durante o período experimental apropriado. A administração por gavagem deve ser feita com uma sonda gástrica. O volume de líquido administrado numa toma não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal (o volume máximo para óleo de milho é de 0,4 ml/100 g de peso corporal); exceptuam-se as soluções aquosas, que podem ser administradas na proporção de 2 ml/100 g de peso corporal. Deve minimizar-se a variabilidade do volume de ensaio efectuando ajustes nas concentrações, de forma a assegurar a constância do volume em todos os níveis de dose; exceptuam-se os casos em que se utilizam substâncias irritantes ou corrosivas, que normalmente exercem efeitos exacerbados quando aplicadas em concentrações mais elevadas. Normalmente, nos estudos com administração por gavagem, as crias amamentadas só recebem a substância de ensaio de forma indirecta, através do leite; a dosagem directa inicia-se apenas na altura do desmame. Nos estudos em que a substância de ensaio é administrada na alimentação ou na água de beber, as crias podem receber uma quantidade adicional da substância de ensaio quando, na última semana do período de lactação, começam a comer por si próprias.

É importante assegurar que as quantidades de substância de ensaio administradas através da alimentação ou da água de beber não interferem nas exigências normais de nutrição ou de consumo de água. Quando a substância de ensaio for incorporada na alimentação, pode utilizar-se uma concentração alimentar constante (ppm) ou, alternativamente, um nível de dose constante em relação ao peso corporal dos animais; deve especificar-se o método escolhido para o ensaio. No caso de uma substância administrada por gavagem, a dose deve ser administrada todos os dias à mesma hora, devendo ser ajustada pelo menos uma vez por semana a fim de se manter uma dose constante em relação ao peso corporal do animal; estes ajustes deverão ser feitos tendo em conta os dados relativos à distribuição placentária.

1.4.6 Plano da experiência

A substância de ensaio começa a ser administrada diariamente aos machos e fêmeas progenitores (P) ao atingirem entre 5 e 9 semanas de idade. A dosagem diária dos machos e fêmeas F1 deve começar na altura do desmame; importa ter presente que, quando a substância de ensaio é administrada através da alimentação ou na água de beber, pode ocorrer exposição directa das crias da geração F1 à substância de ensaio durante o período de lactação. O tratamento de ambos os sexos das gerações P e F1 deve decorrer durante pelo menos 10 semanas antes do acasalamento, prosseguindo nas duas semanas do período de acasalamento. Os machos devem ser sacrificados e examinados quando deixam de ser necessários para avaliação de efeitos sobre o aparelho reprodutor. A dosagem das fêmeas progenitoras (P) deve continuar durante a gravidez, prolongando-se até ao desmame da prole F1. O esquema de administração poderá ser modificado com base em informações relativas à substância de ensaio, incluindo dados sobre toxicidade, indução de metabolismo ou bioacumulação. Normalmente, a dose a administrar a cada animal é calculada com base na determinação mais recente do seu peso corporal. No entanto, o ajuste das doses durante o último terço da gravidez deve ser feito com precaução.

O tratamento dos machos e fêmeas P e F1 deve continuar até ao momento do sacrifício. Todos os machos e fêmeas adultos P e F1 devem ser sacrificados quando deixarem de ser necessários para avaliação de efeitos sobre a reprodução. Os animais da descendência F1 não seleccionados para acasalamento e todos os descendentes F2 deverão ser sacrificados após o desmame.

1.4.7 Processo de acasalamento

1.4.7.1 Acasalamento dos progenitores (P)

Para o acasalamento, cada fêmea deve ser colocada juntamente com um único macho pertencente ao mesmo nível de dosagem (acasalamento 1:1) até que ocorra cópula ou tenham decorrido duas semanas. As fêmeas devem ser examinadas diariamente para verificar a presença de esperma ou um rolhão vaginal. Considera-se o dia 0 de gravidez aquele em que se observa um rolhão vaginal e/ou esperma. Quando a tentativa de acasalamento for mal sucedida, poderá tentar-se um novo acasalamento das fêmeas com machos do mesmo grupo comprovadamente aptos a procriar. Os pares acasalados devem ser identificados nos dados do ensaio de forma inequívoca. Deve evitar-se o acasalamento entre irmãos.

1.4.7.2 Acasalamento de F1

Para o acasalamento da descendência F1 e produção da geração F2, devem seleccionar-se pelo menos um macho e uma fêmea de cada ninhada, em altura de desmame, para acasalamento com outras crias pertencentes ao mesmo nível de dose mas provenientes de ninhadas diferentes. A selecção das crias de cada ninhada deve ser feita de forma aleatória, desde que não se verifiquem diferenças significativas no peso corporal ou na aparência dos animais. Caso se observem essas diferenças, devem seleccionar-se os animais mais representativos de cada ninhada.

Embora a forma mais correcta de selecção seja aquela que se baseia no peso corporal, em determinadas circunstâncias poderá ser mais conveniente recorrer à aparência. A descendência F1 só deve acasalar depois de ter atingido a maturidade sexual completa.

Os casais sem descendência devem ser avaliados para determinar as causas da aparente esterilidade. Esta avaliação pode envolver novas tentativas de acasalamento com outros machos ou fêmeas comprovadamente aptos a procriar, o exame microscópico dos órgãos reprodutores e a observação dos ciclos do estro ou da espermatogénese.

1.4.7.3 Segundo acasalamento

Em determinadas circunstâncias, tais como situações em que se verifiquem alterações na dimensão da ninhada relacionadas com o tratamento ou em que se observe um efeito ambíguo no primeiro acasalamento, recomenda-se que os adultos P ou F1 acasalem de novo para produzir uma segunda ninhada. O segundo acasalamento de fêmeas ou machos que não tenham produzido ninhadas deverá ser feito com reprodutores comprovados do sexo oposto. Se numa das gerações for estritamente necessário produzir uma segunda ninhada, os animais devem acasalar novamente cerca de uma semana depois do desmame da última ninhada.

1.4.7.4 Dimensão das ninhadas

Os animais devem poder parir normalmente e criar os seus descendentes até ao desmame. A uniformização do tamanho das ninhadas é opcional; caso seja feita, deve descrever-se pormenorizadamente o método usado.

1.5 OBSERVAÇÕES

1.5.1 Observações clínicas

Deve efectuar-se diariamente uma observação clínica geral; nos casos em que a dose é administrada por gavagem, a escolha do momento da observação deve tomar em consideração o período de efeitos máximos previsto que se verifica após a administração da dose. Devem registar-se quaisquer modificações de comportamento, sinais de parto difícil ou prolongado e todos os sinais de toxicidade. Deverá efectuar-se uma inspecção adicional mais pormenorizada de cada animal pelo menos uma vez por semana, que por conveniência poderá coincidir com o momento da pesagem. Para além disso, cada animal deve ser observado duas vezes por dia (ou uma vez por dia durante o fim-de-semana, quando for conveniente) para avaliar morbidade e mortalidade.

1.5.2 Peso corporal e consumo de alimento/água dos animais progenitores

Os animais progenitores (P e F1) devem ser pesados no primeiro dia de tratamento e, em seguida, pelo menos uma vez por semana. O peso das fêmeas progenitoras (P e F1) deve ser determinado, no mínimo, nos dias 0, 7, 14 e 20 ou 21 da gestação, durante a lactação (nos dias coincidentes com a pesagem das crias) e no dia do sacrifício. Estas observações devem ser registadas individualmente para cada animal adulto. Durante os períodos de pré-acasalamento e gestação, o consumo de alimento deve ser medido pelo menos semanalmente. Se a substância de ensaio for administrada na água, o consumo de água deve ser determinado pelo menos uma vez por semana.

1.5.3 Ciclo do estro

A duração e a normalidade do ciclo do estro nas fêmeas P e F1 são avaliadas por observação de esfregaços vaginais obtidos antes do acasalamento, durante o acasalamento (opcional) e até existirem evidências de cópula. A remoção de células vaginais/cervicais deve ser feita cuidadosamente, de modo a evitar o distúrbio da mucosa e a subsequente indução de uma gravidez fictícia (1).

1.5.4 Parâmetros dos espermatozóides

No momento do sacrifício, deverá registar-se o peso dos testículos e do epidídimo de todos os machos P e F1 após o sacrifício. Deve reservar-se um exemplar de cada tipo de órgão para exame histopatológico (ver secções 1.5.7 e 1.5.8.1). Para a contagem de espermatídios e de espermatozóides das reservas do conduto epididimário resistentes a homogeneização, deverão usar-se, respectivamente, os testículos e os epidídimos de subgrupos de pelo menos 10 machos de cada grupo P e F1. Deve colher-se o esperma do conduto epididimário ou do canal deferente dos animais desses subgrupos para avaliar a mobilidade e a morfologia dos espermatozóides. Se forem detectados efeitos relacionados com o tratamento ou se estudos anteriores indicarem possíveis efeitos na espermatogénese, deverão analisar-se os espermatozóides de todos os machos de cada grupo de dose; caso contrário, a contagem pode restringir-se aos machos P e F1 dos grupos de controlo e de dose máxima.

Deve proceder-se à contagem do número total de espermatídios testiculares e de espermatozóides do conduto epididimário resistentes a homogeneização (2)(3). O número de espermatozóides das reservas do conduto pode ser determinado considerando o volume e a concentração de esperma na suspensão usada para a análise qualitativa e efectuando a contagem de espermatozóides após maceração e/ou homogeneização do restante tecido do conduto. As contagens devem ser feitas nos subgrupos de machos seleccionados de todos os grupos de dosagem e ser levadas a efeito imediatamente após o sacrifício dos animais, excepto se forem feitas gravações de vídeo ou digitais ou se os animais forem congelados para análise posterior. Nestes casos, podem analisar-se primeiro os grupos de controlo e de dose máxima; se não se observarem efeitos relacionados com o tratamento (por exemplo, efeitos na contagem, mobilidade ou morfologia dos espermatozóides), não será necessário avaliar os restantes grupos de dose; caso contrário, deverão analisar-se também os grupos de dosagem inferior.

A mobilidade dos espermatozóides do epidídimo (ou do canal deferente) deve ser analisada ou gravada em vídeo imediatamente após o sacrifício. O esperma deve ser retirado o mais rapidamente possível, enquanto os danos são mínimos; seguidamente, deve ser diluído para uma análise de mobilidade usando métodos aprovados (4). A determinação da percentagem de espermatozóides progressivamente móveis poderá ser tanto subjectiva como objectiva. Quando se realiza uma análise de mobilidade assistida por computador (5)(6)(7)(8)(9)(10), a determinação da mobilidade progressiva baseia-se em valores críticos definidos pelo utilizador em relação à velocidade média e à rectitude da trajectória, ou índice linear. Se existirem gravações em vídeo de amostras (11) ou outras imagens obtidas durante a necropsia, pode efectuar-se posteriormente a análise dos machos P e F1 dos grupos de controlo e de dose máxima. Se não se observarem efeitos relacionados com o tratamento, será desnecessário avaliar os restantes grupos de dose; caso contrário, deverão analisar-se também os grupos de dosagem inferior. Caso não existam imagens de vídeo ou digitais, todas as amostras de todos os grupos de tratamento devem ser analisadas no momento da necropsia.

Deve efectuar-se a análise morfológica de uma amostra de espermatozóides epididimários (ou do canal deferente). Depois de fixados, os espermatozóides (pelo menos 200 por amostra) são examinados em preparações húmidas (12) e classificados como normais ou anormais. As anomalias morfológicas em espermatozóides incluem fusão, cabeças isoladas e ausência de cabeças e/ou de caudas.