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Decreto-Lei n.º 27-A/2006 — Altera o Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de…

Tipo Decreto-Lei
Publicação 2006-02-10
Última atualização 2010-08-11
Estado Revogada texto desatualizado
Texto Tal como publicado
Ministério Ministério do Ambiente, do Ordenamento do Território e do Desenvolvimento Regional
Fonte DRE
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artigos 5

Este é o ato tal como foi publicado. As alterações posteriores não estão incorporadas no texto: cada uma é um ato autónomo neste repositório e uma entrada no historial desta lei.

1 ato modificativo · 2010-08-11, Decreto-Lei n.º 98/2010 — Estabelece o regime a que obedecem a classificação, embalagem e…

Altera o Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas, transpondo para a ordem jurídica nacional a Directiva n.º 2004/73/CE, da Comissão, de 29 de Abril

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A avaliação deve ser feita nos subgrupos de machos seleccionados de todos os grupos de dose, quer imediatamente após o sacrifício dos animais, quer posteriormente, usando gravações de vídeo ou digitais. Depois de fixados, os esfregaços podem também ser guardados para análise posterior. Nestas situações, podem analisar-se primeiro os grupos de controlo e de dose máxima. Se não se observarem efeitos relacionados com o tratamento (por exemplo, efeitos na morfologia dos espermatozóides), não será necessário analisar os restantes grupos de dose; caso contrário, deverão analisar-se também os grupos de dosagem inferior.

Caso um dos parâmetros de avaliação de espermatozóides acima mencionados tenha sido examinado anteriormente num estudo sistémico de toxicidade de pelo menos 90 dias, poderá considerar-se desnecessário repetir a sua avaliação no estudo em duas gerações. Recomenda-se, no entanto, que se guardem amostras ou gravações digitais de espermatozóides da geração P para possibilitar uma avaliação posterior, caso esta venha a ser necessária.

1.5.5 Descendência

Cada ninhada deve ser examinada o mais cedo possível após o parto (dia 0 de lactação) para se determinar o número e o sexo das crias, os nados-mortos, os nados-vivos e a presença de anomalias macroscópicas. Caso não se encontrem maceradas, as crias encontradas mortas no dia 0 devem ser examinadas para determinar eventuais malformações e a causa da morte; estes animais devem manter-se conservados. As crias vivas devem ser contadas e pesadas individualmente no momento do nascimento (dia 0 de lactação) ou no dia 1; a partir daí, os pesos devem ser avaliados em dias regulares de pesagem, por exemplo, nos dias 4, 7, 14 e 21 de lactação. Devem registar-se as alterações físicas ou de comportamento observadas nas mães ou nos descendentes.

A avaliação do desenvolvimento físico da descendência deve basear-se principalmente no aumento do peso corporal. Outros parâmetros físicos (por exemplo, abertura dos olhos e ouvidos, erupção dos dentes, crescimento de pêlo) poderão dar informações suplementares. No entanto, estes dados deverão ser considerados preferencialmente no contexto da maturação sexual (por exemplo, idade e peso corporal no momento da abertura vaginal ou da separação bálano-prepucial) (13). Devem efectuar-se avaliações de desempenho (por exemplo, actividade motora, função sensorial e ontogenia dos reflexos) da descendência F1 antes e/ou depois do desmame, dedicando especial atenção aos aspectos relacionados com a maturação sexual, caso não tenham sido incluídas em estudos independentes. Deve determinar-se a idade da abertura vaginal e da separação do prepúcio nos animais recém-desmamados seleccionados para acasalamento. Se forem detectadas alterações na proporção entre os sexos ou no tempo de maturação sexual dos animais F1, deverá medir-se a distância anogenital das crias F2 no dia 0 pós-natal.

As observações de desempenho poderão ser omitidas em grupos que revelem claramente outros sinais de efeitos adversos (por exemplo, um decréscimo significativo na progressão do peso, etc.). Caso se realizem, as avaliações de desempenho não devem ser efectuadas em crias seleccionadas para acasalamento.

1.5.6 Necropsia macroscópica

Todos os animais progenitores (P e F1), bem como todas as crias apresentando anomalias externas ou sinais clínicos e uma cria seleccionada aleatoriamente das gerações F1 e F2, escolhida ao acaso quanto ao sexo e à ninhada de origem, devem ser analisados macroscopicamente no momento do sacrifício ou da morte no decurso do estudo para se detectar qualquer anomalia estrutural ou alteração patológica; deverá dedicar-se uma atenção especial aos órgãos do aparelho reprodutor.

Caso não se encontrem maceradas, as crias sacrificadas, em estado moribundo ou encontradas mortas devem ser examinadas para se determinarem eventuais malformações e/ou a causa da morte; estes animais devem manter-se conservados.

Devem examinar-se os úteros de todas as fêmeas primíparas a fim de se detectarem a presença e o número de locais de implantação; este exame deverá ser feito de forma a não comprometer a avaliação histopatológica.

1.5.7 Pesagem dos órgãos

No momento do sacrifício, deverá determinar-se o peso do corpo e dos seguintes órgãos de todos os animais progenitores P e F1 (os órgãos pares devem ser pesados individualmente):

Devem determinar-se os pesos corporais terminais das crias F1 e F2 seleccionadas para necropsia, devendo ainda pesar-se o cérebro, o baço e o timo de uma cria seleccionada aleatoriamente quanto ao sexo e à ninhada de origem (ver secção 1.5.6).

Sempre que possível, a avaliação dos resultados da necropsia macroscópica e da pesagem de órgãos deverá ser efectuada tendo em conta os dados de outros estudos de dose repetida.

1.5.8 Histopatologia

1.5.8.1 Animais progenitores

Devem ser fixados e conservados em meio adequado para exame histopatológico os seguintes órgãos e tecidos de animais progenitores (P e F1) (ou amostras representativas):

Serão objecto de um exame histopatológico completo os órgãos e tecidos conservados acima mencionados de todos os animais P e F1 dos grupos de controlo e de dose máxima seleccionados para acasalamento. A inspecção dos ovários dos animais P é opcional. Serão examinados os órgãos que apresentem alterações relacionadas com o tratamento dos animais dos grupos de doses média e baixa, a fim de auxiliar a determinação do NSEAO.

Adicionalmente, deverá efectuar-se a avaliação histopatológica dos órgãos reprodutores de animais dos grupos de dose média e baixa suspeitos de fertilidade reduzida (por exemplo, animais com insucesso no acasalamento, concepção, geração ou parto de uma descendência saudável, ou animais com alterações nos ciclos do estro ou no número, mobilidade ou morfologia dos espermatozóides). Deverão examinar-se todas as lesões macroscópicas, tais como atrofias ou tumores.

Os testículos devem ser objecto de um exame histopatológico pormenorizado (por exemplo, usando fixador de Bouin, inclusão em parafina e secções transversais com 4-5 mm de espessura) a fim de se detectarem efeitos relacionados com o tratamento, tais como retenção de espermatídios, ausência de camadas ou tipos de células germinais, células gigantes multinucleadas ou perda de células espermatogénicas para o lúmen (14). O exame do epidídimo intacto deve abranger a cabeça, o corpo e o conduto e pode efectuar-se por observação de uma secção longitudinal. A análise do epidídimo destina-se a detectar infiltração de leucócitos, alteração na prevalência de tipos de células, tipos de células aberrantes e fagocitose de espermatozóides. Os órgãos reprodutores masculinos podem ser examinados recorrendo ao uso de PAS (ácido p-aminossalicílico) e coloração com hematoxilina.

Os ovários no período pós-lactação devem conter folículos primordiais e folículos em crescimento, bem como os grandes corpos amarelos da lactação. O exame histopatológico deverá detectar uma diminuição qualitativa da população de folículos primordiais. As fêmeas F1 devem ser submetidas a uma avaliação quantitativa dos folículos primordiais; o número de animais, a selecção da secção do ovário e o tamanho da amostra seccionada devem ser adequados, do ponto de vista estatístico, para o procedimento de avaliação usado. O exame deve incluir a contagem do número de folículos primordiais (que poderão estar combinados com pequenos folículos em crescimento) em ovários de tratamento e em ovários de controlo, para posterior comparação de resultados (15)(16)(17)(18)(19).

1.5.8.2 Animais recém-desmamados

Devem ser fixados e conservados em meio apropriado para exame histopatológico os tecidos e órgãos alvo com anomalias macroscópicas de todas as crias que apresentem anomalias externas ou sinais clínicos, bem como de uma cria seleccionada aleatoriamente das gerações F1 e F2, escolhida ao acaso quanto ao sexo e à ninhada de origem e que não tenha sido seleccionada para acasalamento. Deve efectuar-se a caracterização histopatológica completa do tecido conservado, dando especial atenção aos órgãos do aparelho reprodutor.

2 DADOS

2.1 TRATAMENTO DOS RESULTADOS

Os dados devem ser registados individualmente e resumidos na forma de quadros, indicando, em relação a cada grupo de ensaio e cada geração, o número de animais no início do ensaio, o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou sacrificados, o momento de todas as mortes ou sacrifícios, o número de animais férteis, o número de fêmeas grávidas, o número de animais com manifestações de toxicidade, uma descrição dos sinais de toxicidade observados (incluindo o momento do aparecimento, a duração e a intensidade), os tipos de observações feitas nos progenitores e nos descendentes, os tipos de alterações histopatológicas e todos os dados relevantes relativos às ninhadas.

Os resultados numéricos devem ser avaliados com um método estatístico adequado e geralmente aceite; a escolha do método estatístico deve constar do planeamento do estudo e ser devidamente justificada. Os modelos estatísticos dose-resposta podem ser úteis para a análise dos dados. O relatório deve incluir informação suficiente sobre o método de análise e o programa informático usados para que um examinador/estatístico independente possa reavaliar e reconstituir a análise.

2.2 ANÁLISE DOS RESULTADOS

Os dados recolhidos no estudo de toxicidade sobre a reprodução em duas gerações, incluindo os relativos aos exames microscópicos e necropsias, deverão ser analisados em termos dos efeitos observados. A análise deverá considerar a relação (ou a ausência de relação) entre a dose da substância de ensaio e a presença ou ausência, incidência e gravidade de anomalias, incluindo lesões macroscópicas, órgãos identificados como alvos, alterações da fertilidade, anomalias clínicas, alterações da reprodução e procriação, alterações do peso corporal, efeitos na mortalidade e quaisquer outros efeitos tóxicos. A análise dos resultados do ensaio deve ainda ter em conta as propriedades físico-químicas da substância de ensaio, assim como informação toxicocinética, se disponível.

Um ensaio de toxicidade sobre a reprodução bem elaborado deverá fornecer uma estimativa satisfatória do nível sem efeito e dar conhecimento dos efeitos adversos na reprodução, parturição, lactação e desenvolvimento pós-natal, incluindo o crescimento e o desenvolvimento sexual.

2.3 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

A finalidade de um estudo de toxicidade sobre a reprodução em duas gerações consiste na obtenção de informações relativas aos efeitos de exposição repetida a uma substância durante todas as fases do ciclo reprodutor. Mais especificamente, o estudo fornece informações sobre os parâmetros reprodutores, bem como sobre o desenvolvimento, o crescimento, a maturação e a sobrevivência da descendência. A interpretação dos resultados deve tomar em consideração dados de estudos subcrónicos, de desenvolvimento pré-natal e toxicocinéticos, entre outros eventualmente disponíveis. Os resultados deste estudo podem ser usados para avaliar a necessidade de realizar ensaios suplementares sobre uma substância química. A extrapolação dos resultados para a espécie humana tem uma validade limitada; mais adequado será usar os dados do ensaio para obter informação sobre níveis sem efeito e níveis toleráveis de exposição humana (20)(21)(22)(23).

3 RELATÓRIO

RELATÓRIO DO ENSAIO

O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:

Substância de ensaio:

Agente de transporte (se apropriado):

Animais de ensaio:

Condições de ensaio:

Resultados:

Análise dos resultados.

Conclusões, incluindo os valores dos NSEAO para efeitos sobre as mães e os descendentes.

4 REFERÊNCIAS

(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979), Cycles and Seasons, Em: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston e R.V. Short (orgs.), Cambridge, Nova Iorque.

(2) Gray, L.E. et al. (1989), A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108.

(3) Robb, G.W. et al. (1978), Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103-107.

(4) Klinefelter, G.R. et al. (1991), The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5:39-44.

(5) Seed, J. et al. (1996), Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237-244.

(6) Chapin, R.E. et al. (1992), Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267-273.

(7) Klinefelter, G.R. et al. (1992), Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421.

(8) Slott, V.L. et al. (1991), Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458.

(9) Slott, V.L. e Perreault S.D. (1993), Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. Em: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.

(10) Toth, G.P. et al. (1989), The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.

(11) Working, P.K. e M. Hurtt (1987), Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.

(12) Linder, R.E. et al. (1992), Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.

(13) Korenbrot, C.C. et al. (1977), Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298-303.

(14) Russell, L.D. et al. (1990), Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.

(15) Heindel, J.J. e R.E. Chapin (orgs.) (1993), Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.

(16) Heindel, J.J. et al. (1989), Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. Em: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (org.), Plenum, Nova Iorque, pp. 421-426.

(17) Manson, J.M. e Y.J. Kang (1989), Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. Em: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (org.), Raven, Nova Iorque.

(18) Smith, B.J. et al. (1991), Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379-383.

(19) Heindel, J.J. (1999), Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. Em: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston e C.A. Kimmel (orgs.), ILSI Press, Washington, DC.

(20) Thomas, J. A. (1991), Toxic Responses of the Reproductive System. Em: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull e C.D. Klaassen (orgs.), Pergamon, Nova Iorque.

(21) Zenick, H. e E.D. Clegg (1989), Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. Em: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (org.), Raven Press, Nova Iorque.

(22) Palmer, A.K. (1981), Em: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. e J. Buelke-Sam (orgs.), Raven Press, Nova Iorque.

(23) Palmer, A.K. (1978), Em: Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson e F.C. Fraser (orgs.), Plenum Press, Nova Iorque.

ANEXO XI — "A.21. PROPRIEDADES DE COMBURÊNCIA (LÍQUIDOS)

1.

MÉTODO

1.1 INTRODUÇÃO

O presente método de ensaio destina-se à determinação do potencial de uma substância líquida de aumentar a velocidade ou intensidade de combustão de uma substância combustível, ou de formar misturas homogéneas com uma substância combustível que possam sofrer ignição espontânea. O método baseia-se no ensaio da ONU para líquidos comburentes (1), ao qual é equivalente. Todavia, uma vez que o método A.21 se destina essencialmente a satisfazer as exigências da Directiva 67/548/CEE, apenas é necessária a comparação com uma substância de referência. Caso se preveja que os resultados do ensaio sejam utilizados para outros fins, pode ser necessário efectuar ensaios complementares e comparações com outras substâncias de referência (ver nota 1).

Não é necessário realizar o ensaio se uma análise simples da fórmula estrutural da substância permitir estabelecer com um grau de confiança elevado que a mesma não reage exotermicamente com matérias combustíveis.

Antes de realizar o ensaio, é conveniente obter informações sobre eventuais propriedades explosivas da substância.

O método não é aplicável a sólidos, gases e outras substâncias explosivas ou altamente inflamáveis, nem a peróxidos orgânicos.

Não é necessário realizar o ensaio se existirem dados referentes à substância em estudo obtidos por aplicação do ensaio da ONU para líquidos comburentes (1).

1.2 DEFINIÇÕES E UNIDADES

O tempo médio necessário para o aumento da pressão é a média dos tempos determinados necessários para que a pressão da mistura em estudo aumente de 690 kPa para 2070 kPa acima da pressão atmosférica.

1.3 SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA

Utiliza-se como substância de referência uma solução aquosa a 65%, em massa, de ácido nítrico de qualidade analítica. (ver nota 2)

Caso o experimentador preveja que os resultados do ensaio sejam utilizados para outros fins, (ver nota 1) pode revelar-se adequado efectuar ensaios com outras substâncias de referência. (ver nota 3)

(nota 1) Por exemplo, o ensaio no âmbito da regulamentação da ONU relativa ao transporte de mercadorias perigosas.

(nota 2) O ácido deve ser titulado antes do ensaio, de modo a confirmar a sua concentração.

(nota 3) Na referência 1, por exemplo, utilizam-se ácido perclórico a 50%, em massa, e clorato de sódio a 40%, em massa.

1.4 PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

O líquido em estudo é misturado, na proporção 1:1, em massa, com fibras de celulose, e introduzido num recipiente pressurizado. Se, durante o processo de mistura ou enchimento, ocorrer ignição espontânea, não é necessário prosseguir o ensaio.

Caso não ocorra ignição espontânea, realiza-se o ensaio na sua totalidade. A mistura é aquecida no reci-piente pressurizado, determinando-se o tempo médio necessário para que a pressão aumente de 690 kPa para 2070 kPa acima da pressão atmosférica. Este tempo é comparado com o tempo médio necessário para o aumento da pressão da mistura na proporção de 1:1 da(s) substância(s) de referência com celulose.

1.5 CRITÉRIOS DE QUALIDADE

Os resultados de uma série de cinco ensaios com uma determinada substância não devem diferir em mais de 30% da média aritmética. Devem desprezar-se os resultados que mostrem uma divergência superior a 30% relativamente à média, alterando-se os procedimentos de mistura e enchimento, após o que deve repetir-se o ensaio.

1.6 DESCRIÇÃO DO MÉTODO

1.6.1 Preparação

1.6.1.1 Substância combustível

Utilizam-se como matéria combustível fibras de celulose secas, de comprimento compreendido entre 50 e 250 (mi)m e diâmetro médio 25 (mi)m. (ver nota 4) As fibras são secas a massa constante, numa placa de espessura não superior a 25 mm, a 105ºC, durante 4 horas, e mantidas num exsicador com exsicante, até ao arrefecimento e utilização. O teor de humidade da celulose seca deve ser inferior a 0,5% em relação à massa seca (ver nota 5). Para tal, se necessário, deve prolongar-se o tempo de secagem. (ver nota 6) Deve utilizar-se o mesmo lote de celulose em todo o ensaio.

(nota 4) Por exemplo, celulose Whatman para cromatografia em coluna, referência CF 11, n.º de catálogo 4021 050.

(nota 5) Confirmado, por exemplo, através de uma titulação de Karl Fisher.

(nota 6) Como alternativa, pode obter-se o teor de humidade em causa por aquecimento a 105ºC, sob vácuo, durante 24 h.

1.6.1.2 Equipamento

1.6.1.2.1 Dispositivo pressurizado

Deve utilizar-se um dispositivo constituído por um recipiente pressurizado de aço de forma cilíndrica, com 89 mm de comprimento e 60 mm de diâmetro externo (ver figura 1). São maquinadas duas superfícies planas em lados opostos, reduzindo a secção local do recipiente para 50 mm, de modo a facilitar a imobilização durante a colocação dos obturadores de ignição e de ventilação. O recipiente, com um diâmetro interno de 20 mm, é rebaixado internamente em ambas as extremidades até uma profundidade de 19 mm e roscado para tubos normalizados BSP (British Standard Pipe) de 1", ou o seu equivalente no sistema métrico. É enroscada à superfície curva do recipiente pressurizado uma tomada de pressão, a 35 mm de uma das extremidades, perpendicularmente às superfícies planas maquinadas. O encaixe, roscado para receber a rosca da tomada de pressão (tubo normalizado BSP de 1/2", ou o seu equivalente no sistema métrico), é realizado a uma profundidade de 12 mm. Se necessário, é instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar estanquidade aos gases. A tomada de pressão tem um comprimento exterior de 55 mm relativamente ao corpo do dispositivo e um furo axial com 6 mm de diâmetro. A extremidade da tomada de pressão é rebaixada e roscada de forma a receber um transdutor de pressão com diafragma. Pode utilizar-se qualquer dispositivo de medição de pressão que não seja atacado pelos gases de combustão ou produtos de decomposição e seja adequado a aumentos de pressão de 690-2070 kPa em não mais de 5 minutos.

A extremidade do recipiente pressurizado mais distante da tomada de pressão é tapada com um obturador de ignição e munida de dois eléctrodos, um dos quais isolado do corpo do obturador e o outro ligado à massa. A extremidade oposta do recipiente é fechada por um disco de ruptura adequado a uma pressão de ruptura de 2200 kPa, mantido em posição por um obturador de retenção com um furo axial de 20 mm de diâmetro. Se necessário, é instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar estanquidade aos gases. Durante a utilização, o dispositivo é mantido na posição correcta por meio de um suporte (figura 2), geralmente constituído por uma placa de aço macio com 235 mm x 184 mm x 6 mm e um tubo de 185 mm de comprimento e secção quadrada de 70 mm x 70 mm x 4 mm.

São cortados dois lados opostos na extremidade do tubo, de modo a obter uma estrutura constituída por uma secção de tubo intacto com 86 mm de comprimento prolongada por dois lados até à base. As extremidades destes lados são cortadas de modo a formar um ângulo de 60º com a horizontal e soldadas à placa de aço macio que constitui a base. É maquinada num dos lados da extremidade superior da base uma fenda com 22 mm de largura e 46 mm de profundidade, de modo que, ao colocar o dispositivo pressurizado com o obturador de ignição para baixo, a tomada de pressão encaixe na fenda. É soldada à face interna do lado inferior do tubo um espaçador de aço com 30 mm de largura e 6 mm de espessura. O dispositivo pressurizado é mantido firmemente em posição por dois parafusos de orelhas de 7 mm, colocados no lado oposto, e apoiado inferiormente por dois elementos prismáticos de aço de 12 mm de largura e 6 mm de espessura, soldados às peças laterais na base da porção intacta do tubo.

1.6.1.2.2 Sistema de ignição

O sistema de ignição é constituído por um cabo de níquel-crómio de 25 cm de comprimento e 0,6 mm de secção, com uma resistência de 3,85 ohm/m. O cabo é enrolado em forma de bobina por recurso a uma haste de 5 mm de secção, e ligado aos eléctrodos do obturador de ignição. A bobina deve apresentar uma das configurações que se ilustram na figura 3. A distância entre a extremidade inferior do recipiente e a superfície interior da bobina de ignição deve ser de 20 mm. Caso os eléctrodos não sejam ajustáveis, as extremidades do cabo de ignição entre a bobina e a base do recipiente devem ser isoladas por um elemento de cerâmica. O cabo é aquecido por acção de uma corrente contínua de intensidade mínima 10 A.

1.6.2 Realização do ensaio (ver nota 7)

O dispositivo completo, incluindo o transdutor de pressão e o sistema de aquecimento, mas sem o disco de ruptura na respectiva posição, é colocado com o obturador de ignição para baixo. Com o auxílio de um agitador de vidro (ver nota 8), misturam-se num recipiente de vidro 2,5 g do líquido em estudo com 2,5 g de celulose seca. Por motivos de segurança, a mistura deve ser executada com um dispositivo de segurança interposto entre o operador e a mistura. Em caso de ignição durante os processos de mistura ou o enchimento, não é necessário prosseguir o ensaio. A mistura é vertida em pequenas porções no recipiente pressurizado, agitando ligeiramente, devendo assegurar-se a acumulação em torno da bobina de ignição, de forma a estabelecer um bom contacto. A bobina não deve ser distorcida durante o processo de enchimento, facto que poderia determinar resultados erróneos (ver nota 9). O disco de ruptura é colocado na respectiva posição e o obturador de retenção enroscado firmemente. O recipiente carregado, com o disco de ruptura no topo, é transferido para o suporte, que deve estar colocado numa chaminé ou câmara com protecção. A fonte de alimentação é ligada aos terminais externos do obturador de ignição, aplicando-se uma corrente de 10 A.

O tempo decorrido entre o início da mistura e o estabelecimento da corrente eléctrica não deve exceder 10 minutos.

O sinal produzido pelo transdutor de pressão é transmitido a um sistema adequado que permita a detecção e o registo contínuos da alteração da pressão (por exemplo, um detector em contínuo acoplado a um registador). A mistura é aquecida até à ruptura do disco de ruptura ou até terem decorrido, pelo menos, 60 segundos. Caso o disco não sofra ruptura, deve deixar-se arrefecer a mistura antes de desmontar cuidadosamente o dispositivo, tomando as precauções inerentes a uma eventual pressurização. Realizam-se cinco ensaios com a substância em estudo e a(s) substância(s) de referência. Regista-se o tempo necessário para a pressão aumentar de 690 kPa para 2070 kPa acima da pressão atmosférica, calculando-se então o tempo médio necessário para o aumento da pressão.

Algumas substâncias produzem um aumento de pressão excessivo ou demasiado reduzido, determinado por reacções químicas independentes das propriedades de comburência das substâncias. Nesses casos, pode ser necessário repetir o ensaio, utilizando uma substância inerte, como, por exemplo, terra de diatomáceas (kieselguhr), em vez da celulose, de modo a esclarecer a natureza da reacção.

(nota 7) As misturas de substâncias comburentes com celulose devem ser consideradas potencialmente explosivas, devendo manipular-se com os devidos cuidados.

(nota 8) Na prática, pode preparar-se uma quantidade de mistura na proporção 1:1 do líquido em estudo com celulose superior à necessária para o ensaio, transferindo 5 (mais ou menos) 0,1 g da mesma para o recipiente pressurizado. A mistura deve ser preparada antes de cada ensaio.

(nota 9) Deve evitar-se, em especial, o contacto entre espiras adjacentes da bobina.

2 DADOS

Tempos necessários para o aumento da pressão da(s) substância(s) em estudo e de referência.

Tempos necessários para o aumento da pressão no caso dos ensaios com substâncias inertes, se for caso disso.

2.1 TRATAMENTO DOS RESULTADOS

Calculam-se os tempos médios necessários para o aumento da pressão da(s) substância(s) em estudo e de referência.

Calcula-se o tempo médio necessário para o aumento da pressão no ensaio com a substância inerte, se realizado.

O Quadro 1 fornece alguns exemplos de resultados:

QUADRO 1

(ver quadro no documento original)

3 RELATÓRIO

3.1 RELATÓRIO DE ENSAIO

O relatório de ensaio deve incluir as seguintes informações:

3.2 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS (ver nota 10)

Os resultados do ensaio são interpretados com base nos seguintes critérios:

a)

Eventual ignição espontânea da mistura da substância em estudo com celulose; e

b)

Comparação do tempo médio necessário para o aumento da pressão de 690 kPa para 2070 kPa com idêntico parâmetro da(s) substância(s) de referência.

Uma substância líquida é considerada comburente se:

a)

Uma mistura da substância com celulose na proporção 1:1, em massa, exibir ignição espontânea; ou

b)

Uma mistura na proporção 1:1, em massa, exibir um tempo médio necessário para o aumento da pressão inferior ou igual ao tempo médio necessário para o aumento da pressão de uma mistura na proporção 1:1, em massa, de solução aquosa de ácido nítrico a 65% (em massa) e celulose.

De modo a evitar falsos resultados positivos, podem ser também tidos em conta na interpretação dos resultados, se tal for considerado necessário, os resultados obtidos num ensaio da substância em estudo com uma substância inerte.

(nota 10) Ver a referência n.º 1 para a interpretação dos resultados no âmbito da regulamentação da ONU relativa ao transporte de mercadorias perigosas, utilizando várias substâncias de referência.

4 REFERÊNCIAS

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria 3.ª edição revista. Publicação da ONU No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, pág. 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

FIGURA 1

Dispositivo pressurizado

(ver figura no documento original)

FIGURA 2

Suporte do dispositivo

(ver figura no documento original)

FIGURA 3

Sistema de ignição

(ver figura no documento original)

ANEXO XII — "B.42. SENSIBILIZAÇÃO DA PELE: ENSAIO DE GÂNGLIO LINFÁTICO LOCAL

1.

MÉTODO

O presente método baseia-se na publicação OECD TG 429 (2002) (normas de ensaio da OCDE).

1.1 INTRODUÇÃO

O Ensaio de Gânglio Linfático Local (LLNA) tem sido suficientemente validado e aceite de modo a justificar a sua adopção como um novo Método (1)(2)(3). Este ensaio é o segundo método para avaliar o potencial de sensibilização da pele de animais por produtos químicos. O outro método (B.6) utiliza ensaios com cobaias, nomeadamente o ensaio de maximização da cobaia e o ensaio de Buehler (4).

O LLNA constitui um método alternativo a utilizar na identificação de produtos químicos sensibilizantes da pele e na confirmação da ausência de um potencial significativo causador de sensibilização da pele por parte de certos produtos químicos. Tal facto não implica necessariamente que o LLNA seja sempre utilizado em substituição do ensaio com cobaia, mas apenas que o primeiro apresenta qualidades equivalentes ao segundo e pode ser utilizado como uma alternativa em situações nas quais não seja necessária confirmação posterior dos resultados, quer estes sejam positivos ou negativos.

O LLNA apresenta determinadas vantagens no que diz respeito tanto ao progresso científico como à protecção dos animais. O Método estuda a fase de indução da sensibilização da pele e proporciona dados quantitativos adequados para a avaliação da resposta à dosagem. Foram publicados dados detalhados sobre a validação do LLNA e uma revisão do trabalho associado (5)(6)(7)(8). Além disso, deve referir-se que os sensibilizadores intermédios/moderados, que se recomendam como substâncias adequadas para controlo positivo dos métodos de cobaia, são igualmente apropriados para utilizar com o LLNA (6)(8)(9).

O LLNA é um método in vivo e, consequentemente, não eliminará a utilização de animais na avaliação da actividade sensibilizante por contacto. Tem, no entanto, a vantagem de reduzir o número de animais requeridos para esta avaliação. Além disso, o LLNA apresenta uma melhoria substancial no modo como os animais são utilizados nos ensaios de sensibilização por contacto. O LLNA baseia-se na observação de acontecimentos imunológicos estimulados por produtos químicos durante a fase de indução da sensibilização. Ao contrário dos ensaios com cobaias, o LLNA não requer a ocorrência de reacções de hipersensibilidade dérmica provocadas por um agente externo. Além disso, o LLNA não implica que seja utilizado qualquer adjuvante, como acontece no ensaio de maximização da cobaia, reduzindo as perturbações causadas ao animal. Apesar das vantagens do LLNA em relação aos ensaios tradicionais com cobaias, importa reconhecer que existem certas limitações neste método que podem exigir a utilização de ensaios tradicionais com cobaias (por exemplo, falsos negativos no LLNA para certos metais, falsos positivos para certos irritantes da pele)(10).

Ver igualmente a Introdução, parte B.

1.2 PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

O princípio básico subjacente ao LLNA é o de que os sensibilizadores induzem uma proliferação primária de linfócitos no gânglio linfático que leva à secagem do local de aplicação do produto químico. Esta proliferação é proporcional à dose aplicada (e à potência do alérgeno) e constitui um modo simples de obter uma medida quantitativa objectiva da sensibilização. O LLNA avalia esta proliferação numa relação de dose/resposta na qual a proliferação em grupos de ensaio é comparada com a obtida em controlos tratados com o excipiente. É determinada a razão entre a proliferação nos grupos ensaiados e a observada em controlos tratados com o excipiente. Esta razão denomina-se Índice de Estimulação e deve apresentar o valor de, pelo menos, três para que uma substância de ensaio possa ser posteriormente avaliada como potencial sensibilizadora da pele. Os métodos descritos no presente documento baseiam-se na utilização de marcação radioactiva para medir a proliferação celular. Podem, no entanto, ser utilizados outros conceitos para a avaliação da proliferação desde que existam justificação e apoio científico adequado, incluindo citações integrais e uma descrição da metodologia.

1.3 DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.3.1 Preparativos

1.3.1.1 Condições de alojamento e alimentação

Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotério deve ser de 22ºC ((mais ou menos) 3ºC). Embora a humidade relativa deva ser de, pelo menos, 30% e, de preferência, não exceder os 70% excepto durante o período de limpezas, o valor pretendido deve ser de 50-60%. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação podem ser utilizadas dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem restrições.

1.3.1.2 Preparação dos animais

Os animais são seleccionados aleatoriamente, marcados de modo a permitir a identificação individual (embora nunca se deva recorrer a marcação nas orelhas) e mantidos em gaiolas durante, pelo menos, 5 dias antes do início da aplicação da dose, de modo a permitir a aclimatação às condições do laboratório. Antes do início do tratamento, todos os animais são examinados de modo a assegurar que não apresentam lesões visíveis da pele.

1.3.2 Condições do ensaio

1.3.2.1 Animais experimentais

O rato é a espécie de eleição para o presente ensaio. Utilizam-se ratos fêmeas adultas das estirpes CBA/Ca ou CBA/J, nulíparas e não grávidas. No início do estudo, os animais devem ter entre 8 e 12 semanas de idade e a variação de peso dos animais deve ser mínima e não deve exceder 20% do seu peso médio. Podem ser utilizadas outras estirpes e machos quando houver uma quantidade suficiente de dados que demonstrem não existirem diferenças significativas na resposta ao LLNA relacionadas com a estirpe e/ou o género do animal.

1.3.2.2 Verificação da fiabilidade

Utilizam-se controlos positivos a fim de demonstrar o desempenho adequado do ensaio e a competência do laboratório para levar a cabo o ensaio com sucesso. O controlo positivo deve produzir uma resposta LLNA positiva ao nível de exposição à qual se espera um aumento do índice de estimulação (SI)(maior que)3 em relação ao grupo do controlo negativo. A dose do controlo positivo deve ser escolhida de modo que a indução seja evidente, mas não excessiva. As substâncias preferidas são o aldeído hexilcinâmico (CAS No 101-86-0, EINECS No 202-983-3) e o mercaptobenzotiazole (CAS No 149-30-4, EINECS No 205-736-8). Em certas circunstâncias e perante justificação adequada, podem ser utilizadas outras substân-cias de controlo que cumpram os critérios supramencionados. Embora seja geralmente requerido um grupo de controlo positivo para cada ensaio, podem ocorrer situações nas quais os ensaios laboratoriais apresentem um historial de dados de controlos positivos que documentem a consistência de uma resposta satisfatória por um período igual ou superior a seis meses. Nessas situações, pode ser apropriado efectuar ensaios menos frequentes com controlos positivos a intervalos não superiores a 6 meses. Embora a substância de controlo positivo deva ser ensaiada no excipiente para a qual é conhecida uma resposta consistente (por exemplo, acetona, azeite), podem existir certas situações regulamentares nas quais será igualmente necessário o ensaio com um excipiente não convencional (formulação clínica e/ou quimicamente relevante). Nessas condições, deve ser ensaiada a possível interacção de um controlo positivo com este excipiente não convencional.

1.3.2.3 Número de animais, níveis de dosagem e selecção do excipiente

Utilizam-se quatro animais, no mínimo, em cada grupo de dosagem e um mínimo de três concentrações da substância de ensaio, além de um controlo negativo tratado apenas com o excipiente para a substância de ensaio e, caso seja apropriado, um controlo positivo. Nos casos em que devam ser recolhidos dados individuais de cada animal, são utilizados, no mínimo, cinco animais por grupo de dosagem. Os animais nos grupos de controlo devem ser manuseados de modo idêntico ao dos animais nos grupos em tratamento, com excepção da ausência de tratamento com a substância de ensaio.

A escolha da dosagem e do excipiente deve basear-se nas recomendações fornecidas na referência (1). As doses são seleccionadas a partir da seguinte série de concentrações: 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5%, etc. Devem ser considerados, desde que disponíveis, quaisquer dados pré-existentes referentes a toxicidade aguda e irritação dérmica, na escolha das três concentrações consecutivas, de modo que a concentração mais alta maximize a exposição evitando ao mesmo tempo a toxicidade sistémica e a irritação local excessiva da pele (2)(11).

O excipiente deve ser escolhido com base na maximização das concentrações de ensaio e na solubilidade, produzindo também uma solução ou suspensão adequadas para aplicação da substância de ensaio. Os excipientes recomendados são, por ordem de preferência, o sistema acetona/azeite (4:1 v/v), dimetilformamida, metiletilcetona, propilenoglicol e dimetilsulfóxido (2)(10), embora possam ser utilizados outros se forem fornecidas bases científicas suficientes. Em certas situações, pode ser necessário efectuar um controlo adicional com um solvente clinicamente relevante ou uma formulação comercial na qual a substância de ensaio é comercializada. Deve ser tomado especial cuidado de modo a assegurar que os materiais hidrofílicos sejam incorporados num sistema de excipiente que molhe a pele e não escorra imediatamente. Devem ser portanto evitados os excipientes completamente aquosos.

1.3.3 Procedimento de ensaio

1.3.3.1 Calendário experimental

O calendário experimental do ensaio é o seguinte:

. Dia 1:

Identificar individualmente e anotar o peso de cada animal. Aplicar a descoberto no dorso de cada orelha 25 (mi)l da diluição adequada da substância de ensaio, do excipiente sozinho ou do controlo positivo (conforme o caso).

. Dias 2 e 3:

Repetir o procedimento de aplicação efectuado no dia 1.

. Dias 4 e 5 :

Não se faz tratamento.

. Dia 6 :

Anotar o peso de cada animal. Injectar 250 (mi)l de tampão salino de fosfato (PBS) contendo 20 (mi)Ci (7,4e + 8 Bq) de (elevado a 3)H-metiltimidina em todos os ratos de ensaio e de controlo através da veia da cauda. Em alternativa, injectar 250 (mi)L de PBS contendo 2 (mi)Ci (7,4e + 7 Bq) de (elevado a 125)I-iododeoxiuridina e 10(elevado a -5) M de fluorodeoxiuridina em todos os ratos através da veia da cauda.

Cinco horas depois, matam-se os animais. Os gânglios linfáticos auriculares em esvaziamento são cortados e demolhados em PBS, reunindo-se aqueles de cada grupo experimental (procedimento de conjunto de grupo de tratamento); em alternativa, podem cortar-se pares de gânglios linfáticos de cada animal e reuni-los em PBS para cada animal (procedimento de animal individual). Podem ser consultados pormenores e esquemas de identificação de gânglios e sua dissecção no Anexo I da referência 10.

1.3.3.2 Preparação das suspensões celulares

Prepara-se uma só suspensão de células de gânglio linfático (LNC) quer a partir do conjunto dos grupos de tratamento, quer a partir dos animais individuais tratados bilateralmente, por desagregação mecânica suave através de um peneiro de aço inoxidável com uma malha de 200 (mi)m. As células de gânglio linfático são lavadas duas vezes com excesso de PBS e precipitadas com uma solução de 5% em ácido tricloroacético (TCA) a 4ºC durante 18 horas (1). Os sedimentos podem ser ressuspendidos em 1 ml de TCA e transferidos para frascos de contador de cintilações contendo 10 ml de fluido de cintilação para contagem de (elevado a 3)H ou transferidos directamente para tubos de contagem gama para contagem de (elevado a 125)I.

1.3.3.3 Determinação da proliferação celular (radioactividade incorporada)

A incorporação de (elevado a 3)H-metiltimidina é medida por contagem de cintilação b em desintegrações por minuto (DPM). A incorporação de (elevado a 125)I-iododeoxiuridina é medida por contagem de (elevado a 125)I e exprime-se igualmente em DPM. Consoante o procedimento seguido, a incorporação será expressa em DPM/grupo de tratamento (procedimento de conjunto) ou em DPM/animal (procedimento individual).

1.3.3.4 Observações

1.3.3.4.1 Observações clínicas

Os animais devem ser cuidadosamente observados uma vez por dia com vista à detecção de quaisquer sinais clínicos quer de irritação local no ponto de aplicação quer de toxicidade sistémica. Todas as observações são sistematicamente anotadas, devendo manter-se registos individuais para cada animal.

1.3.3.4.2 Pesos corporais

Tal como mencionado na secção 1.3.3.1, deve ser medido o peso corporal de cada animal quer no início do ensaio quer na altura da sua morte.

1.3.4 Análise dos resultados

Os resultados expressam-se em Índices de Estimulação (SI). Caso se utilize o procedimento de conjunto, o SI obtém-se pela razão entre a incorporação conjunta de radioactividade para cada grupo de tratamento e a incorporação conjunta do grupo de controlo com excipiente. O valor obtido corresponde ao SI médio. Caso se utilize o procedimento individual, o SI é determinado dividindo a média do DPM/animal dentro de cada grupo de tratamento e do grupo controlo positivo pela média da DPM/animal do grupo de controlo com solvente/excipiente. O SI médio para os controlos tratados com excipiente deve ser 1.

A utilização do procedimento individual para cálculo do SI permitirá que se efectue uma análise estatística dos dados. Na escolha do método de análise estatística mais apropriado, o investigador deve estar ciente das possíveis discrepâncias das variâncias e de outros problemas relacionados que possam exigir uma transformação de dados ou uma análise estatística não paramétrica. Um procedimento adequado à interpretação dos dados consiste em avaliar individualmente todos os dados obtidos para os controlos tratados e com excipiente e determinar a curva de resposta à dosagem que melhor se ajustar a estes, tendo em conta os limites de confiança (8)(12)(13). Contudo, o investigador deve estar atento a possíveis respostas isoladas para determinados animais dentro de um grupo, que podem implicar a utilização de uma medida de resposta alternativa (por exemplo, mediana em vez de média) ou a eliminação da resposta isolada.

O processo de decisão respeitante a uma resposta positiva inclui um índice de estimulação (igual ou maior que) 3 conjuntamente com a consideração da resposta à dosagem e, quando apropriado, do grau de significância estatístico (3)(6)(8)(12)(14).

Se for necessária uma clarificação dos resultados obtidos, devem ser tidas em consideração as várias propriedades da substância de ensaio, incluindo se esta possui uma estrutura química semelhante a sensibilizadores conhecidos da pele, se causa irritação excessiva da pele e qual a natureza da resposta à dosagem observada. Estas e outras considerações são analisadas detalhadamente na referência (7).

2 DADOS

Os dados devem ser apresentados resumidamente sob a forma de uma tabela da qual constem os valores médios e individuais de DPM e os índices de estimulação para cada grupo de doses (incluindo o controlo com excipiente).

3 RELATÓRIO

RELATÓRIO DO ENSAIO

O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:

Substância de ensaio:

Excipiente:

Animais de ensaio:

Condições do ensaio:

Verificação da fiabilidade:

Resultados:

Análise dos resultados:

4 REFERÊNCIAS

(1) Kimber, I. e Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology, 30, 165-169.

(2) Kimber, I., Derman, R.J., Scholes E.W, e Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.

(3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-579.

(4) Método de Ensaio B.6.

(5) Chamberlain, M. e Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002.

(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. e Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay - A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.

(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. e Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 36, 327-333.

(8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.

(9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. e Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-284.

(10) National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).

(11) Método de Ensaio B.4.

(12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. e Botham, P.A. (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.

(13) Basketter D.A., Lea, L.J., Dickens, A., Briggs, D., Pate, I., Dearman, R.J., Kimber, I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.

(14) Basketter D.A., Blaikie, L., Derman R.J., Kimber, I., Ryan, C.A., Gerberick, G.F., Harvey, P., Evans, P., White, I.R. and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis, 42 , 344-348.

B.43. ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE EM ROEDORES

1.

MÉTODO

O presente método é equivalente ao "Test Guideline" TG 424 da OCDE (1997).

O presente Método de Ensaio foi concebido para obter a informação necessária para confirmar ou conseguir uma melhor caracterização da potencial neurotoxicidade de substâncias químicas em animais adultos. Pode ser combinado com Métodos de Ensaio para estudos de toxicidade de dose repetida ou efectuado como um estudo independente. Recomenda-se a consulta do Documento de Orientação da OCDE sobre Estratégias e Métodos de Ensaios de Neurotoxicidade (1) para a concepção dos estudos baseados no presente Método de Ensaio. Este facto é particularmente importante no caso de se considerarem alterações das observações ou dos procedimentos de ensaio recomendados para uso rotineiro do presente Método. O Documento de Orientação foi preparado para facilitar a selecção de outros procedimentos de ensaio para uso em circunstâncias específicas.

A avaliação de neurotoxicidade em relação ao desenvolvimento não é abrangida pelo presente Método.

1.1 INTRODUÇÃO

Na avaliação das características tóxicas das substâncias químicas, é importante considerar o potencial de efeitos neurotóxicos. O Método de Ensaio para toxicidade sistémica de dose repetida inclui observações conducentes ao rastreio de neurotoxicidade potencial. O presente Método de Ensaio pode ser utilizado na concepção de um estudo para obtenção de informação suplementar ou para confirmação dos efeitos observados nos estudos de toxicidade sistémica de dose repetida. No entanto, uma ponderação da neurotoxicidade potencial de certo tipo de substâncias químicas pode ser indicativa de esta ser avaliada mais apropriadamente utilizando o presente Método, mesmo na ausência de indicações prévias de existência de neurotoxicidade potencial provenientes de estudos de toxicidade sistémica de dose repetida. Tal ponderação pode incluir, por exemplo:

Além disso, podem existir outras circunstâncias para as quais é apropriada a utilização do presente Método de Ensaio. Para informação detalhada, consultar a referência (1).

O presente Método foi desenvolvido de modo a poder ser adaptado às necessidades específicas para a confirmação da neurotoxicidade histopatológica e comportamental de uma substância química, bem como a permitir uma caracterização e quantificação das respostas neurotóxicas.

No passado, a neurotoxicidade foi identificada como neuropatia envolvendo lesões neuropatológicas ou anomalias neurológicas, tais como convulsão, paralisia ou tremores. Apesar da neuropatia ser uma importante manifestação de neurotoxicidade, actualmente, é claro que existem muitos outros sinais de toxicidade no sistema nervoso (por exemplo, perda de coordenação motora, deficiências sensoriais, disfunções da aprendizagem e da memória) que podem não se reflectir em neuropatia ou noutro tipo de estudos.

O presente Método de Ensaio de neurotoxicidade foi concebido para detectar os principais efeitos neurocomportamentais e neuropatológicos em roedores adultos. Apesar dos efeitos comportamentais, mesmo na ausência de alterações morfológicas, poderem reflectir um impacto nefasto no organismo, nem todas as alterações comportamentais são específicas do sistema nervoso. Assim, quaisquer alterações observadas devem ser avaliadas em conjunto com os dados histopatológicos, hematológicos ou bioquímicos relacionados, bem como, com dados provenientes de outros tipos de toxicidade sistémica. O ensaio utilizado, no presente Método, para fornecer uma caracterização e quantificação das respostas neurotóxicas inclui procedimentos histopatológicos e comportamentais específicos que podem ser confirmados por investigações electrofisiológicas e/ou bioquímicas (1)(2)(3)(4).

Os neurotóxicos podem actuar sobre o sistema nervoso em vários alvos e por diversos mecanismos. Dado que não é possível utilizar uma única série de ensaios para avaliar completamente o potencial neurotóxico de todas as substâncias, pode ser necessário utilizar outros ensaios in vivo ou in vitro específicos para o tipo de neurotoxicidade observada ou prevista.

O presente Método de Ensaio, pode também ser utilizado em conjunto com as orientações estabelecidas pelo Documento de Orientação da OCDE sobre Estratégias e Métodos de Ensaios de Neurotoxicidade (1), para a concepção de estudos destinados a uma caracterização suplementar ou um aumento da sensibilidade da quantificação da curva dose-efeito, de modo a obter uma melhor estimativa do nível sem efeito adverso observável ou a confirmar a perigosidade conhecida ou prevista de uma substância química. Por exemplo, os estudos podem ser concebidos para identificar e avaliar o(s) mecanismo(s) neurotóxico(s) ou para obter informação suplementar sobre dados previamente disponíveis a partir do uso de procedimentos de observação neurocomportamental e neuropatológica básicos. Tais estudos necessitam de dados não-replicados que seriam obtidos pelo uso dos procedimentos padronizados recomendados no presente Método, caso esses dados não se encontrem já disponíveis e não sejam considerados necessários para a interpretação dos resultados do estudo.

O presente estudo de neurotoxicidade, quer utilizado independentemente, quer em conjunto com outros métodos permite obter informação para:

O presente Método utiliza a administração oral da substância de ensaio. Podem ser mais apropriadas outras vias de administração (por exemplo, dérmica ou por inalação), pelo que podem ser necessárias modificações dos procedimentos recomendados. A selecção ponderada, da via de administração, depende do perfil de exposição humana e da informação toxicológica e cinética disponível.

1.2 DEFINIÇÕES

Efeito adverso: qualquer alteração à normalidade relacionada com o tratamento que diminua a capacidade de um organismo para sobreviver, reproduzir-se ou adaptar-se ao meio ambiente.

Dose: quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose é expresso em peso (g, mg), de substância de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (por exemplo, mg/kg) ou em concentrações dietéticas constantes (ppm).

Dosagem é um termo geral que inclui a dose, a sua frequência e a duração da aplicação da dose.

Neurotoxicidade é uma alteração adversa na estrutura ou função do sistema nervoso que resulta da exposição a um agente químico, biológico ou físico.

Neurotóxico é um agente químico, biológico ou físico que apresenta potencial para causar neurotoxicidade.

NSEAO: abreviatura para nível sem efeito adverso observável; corresponde à maior dose ou ao maior nível de exposição para o qual não se observam efeitos adversos relacionados com o tratamento.

1.3 PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

A substância química de ensaio é administrada por via oral ao longo de uma gama de doses a vários grupos de roedores de laboratório. São normalmente necessárias doses repetidas e o regime de dosagem pode ser de 28 dias, subcrónico (90 dias) ou crónico (1 ano ou mais). Os procedimentos estabelecidos no presente Método de Ensaio podem também ser usados para um estudo de neurotoxicidade aguda. Os animais são ensaiados de modo a permitir a detecção ou a caracterização de anomalias comportamentais e/ou neurológicas. Durante cada período de observação é avaliada uma gama de comportamentos que podem ser afectados por neurotóxicos. No final do ensaio, um subconjunto de animais de cada sexo e de cada grupo é submetido a perfusão in situ e são preparadas e examinada secções do cérebro, medula espinal e nervos periféricos.

No caso do estudo ser efectuado independentemente para rastreio de neurotoxicidade ou caracterização dos efeitos neurotóxicos, os animais de cada grupo que não são utilizados para perfusão e histopatologia subsequente (consultar a Tabela 1) podem ser utilizados em procedimentos neurocomportamentais, neuropatológicos, neuroquímicos e electrofisiológicos específicos que podem complementar os dados obtidos nos exames padronizados necessários ao presente Método (1). Estes procedimentos suplementares podem ser particularmente úteis nos casos em que as observações empíricas ou os efeitos previstos revelam um tipo ou alvo específicos de neurotoxicidade de determinado agente químico. Alternativamente, os restantes animais podem ser utilizados em avaliações, tais como as necessárias aos Métodos de Ensaio para estudos de dose repetida em roedores.

No caso de se combinarem os procedimentos do presente Método de Ensaio, com os de outros Métodos de Ensaio, é necessário um número suficiente de animais para satisfazer as necessidades de observações de ambos os estudos.

1.4 DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO

1.4.1 Selecção de espécies animais

A espécie preferida de roedores para ensaio é o rato, mas, caso seja apresentada uma justificação, podem ser utilizadas outras espécies de roedores. Devem ser utilizadas estirpes laboratoriais de uso corrente e animais adultos, jovens e saudáveis. As fêmeas devem ser nulíparas e não devem estar grávidas. A aplicação da dose deve começar o mais rapidamente possível após o desmame, preferencialmente com animais que não tenham completado ainda seis semanas e sempre com animais com menos de nove semanas. No entanto, nos casos em que o estudo é combinado com outros estudos, pode ser necessário ajustar este requisito de idade. No início do estudo, a diferença de peso entre os animais deverá ser mínima, não podendo ultrapassar 20% do peso médio de cada sexo. No caso de se efectuar um estudo de dose repetida de curta duração, como estudo preliminar do estudo de longo prazo, os animais utilizados em ambos os estudos devem ser da mesma estirpe e da mesma proveniência.

1.4.2 Condições de alojamento e alimentação

A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 22ºC ((mais ou menos) 3ºC). A humidade relativa deverá ser 50%-60%, embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30% e um máximo que, de preferência, não deverá exceder 70%, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Os ruídos intensos intermitentes devem ser minimizados. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. Quando a substância de ensaio for administrada pela alimentação, a escolha da dieta poderá ser condicionada pela necessidade de assegurar a dosagem adequada. Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do mesmo sexo.

1.4.3 Preparação dos animais

Os animais jovens e saudáveis são distribuídos aleatoriamente pelos grupos de tratamento e de controlo. As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Os animais são marcados de modo a permitir uma identificação individualizada e mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, 5 dias antes do início da administração das doses, de modo a permitir que se aclimatem às condições laboratoriais.

1.4.4 Via de administração e preparação das doses

O presente Método de Ensaio aborda especificamente a administração oral da substância de ensaio. A forma de administração pode ser por sonda esofágica, através da alimentação ou da água de beber ou por cápsulas. Podem ser mais apropriadas outras vias de administração (por exemplo, dérmica ou por inalação), pelo que podem ser necessárias modificações dos procedimentos recomendados. A selecção ponderada da via de administração depende do perfil de exposição humana e da informação toxicológica e cinética disponível. Devem ser apresentadas uma justificação para a selecção da via de administração, bem como as modificações dos procedimentos do Método de Ensaio daí resultantes.

Se for necessário, a substância de ensaio pode ser dissolvida ou suspensa num excipiente apropriado. Recomenda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização de uma solução/suspensão aquosa; caso tal não seja viável, pode considerar-se o uso de uma solução/suspensão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em último caso, poderá eventualmente recorrer-se ao uso de soluções/suspensões noutros excipientes. Devem conhecer-se as características tóxicas dos excipientes. Deverão ser tomadas em consideração as seguintes características do excipiente: efeitos na absorção, distribuição, metabolismo ou retenção da substância de ensaio, que possam modificar as suas características tóxicas e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutricional dos animais.

1.5 PROCEDIMENTOS

1.5.1 Número e sexo dos animais

No caso de o estudo ser efectuado independentemente, devem ser utilizados pelo menos 20 animais (10 fêmeas e 10 machos) em cada grupo de dose e de controlo para a avaliação das observações clínicas e funcionais detalhadas. Pelo menos cinco machos e cinco fêmeas, seleccionados dos grupos de 10 machos e 10 fêmeas, devem ser sujeitos a perfusão e utilizados para neuro-histopatologia detalhada no final do estudo. Nos casos em que apenas é observado um número limitado de animais, num determinado grupo de dose, para detecção de efeitos neurotóxicos, deve considerar-se a inclusão destes animais no grupo seleccionado para perfusão. No caso de o estudo ser efectuado em conjunto com um estudo de toxicidade de dose repetida, deve ser utilizado um número de animais adequado de modo a cumprir os objectivos de ambos os estudos. Na Tabela 1, apresentam-se os números mínimos de animais por grupo para vários estudos combinados. No caso de se planearem grupos de mortes intermédias ou de recuperação para observação da reversibilidade, persistência ou ocorrência retardada de efeitos tóxicos pós-tratamento ou quando são consideradas observações suplementares, o número de animais deve ser aumentado de modo a assegurar que se encontra disponível o número de animais necessário para observação e histopatologia.

1.5.2 Grupos de ensaio e de controlo

Em geral, devem ser utilizados pelo menos três grupos de dose e um grupo de controlo, mas, se pela avaliação de outros dados, não forem previstos quaisquer efeitos a uma dose repetida de 1000 mg/kg de peso corporal/dia, pode ser efectuado um teste-limite. Caso não se encontrem disponíveis dados adequados, pode ser efectuado um estudo preliminar de avaliação da gama, de modo a permitir a determinação das doses a utilizar. Os animais do grupo de controlo devem ser tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de ensaio, com excepção do tratamento com a substância de ensaio. Caso seja utilizado um excipiente, o grupo de controlo deverá receber o volume máximo de excipiente utilizado no ensaio.

1.5.3 Teste de fiabilidade

O laboratório que efectua o estudo deve apresentar dados comprovativos da sua capacidade para efectuar o estudo e relativos à sensibilidade dos procedimentos utilizados. Tais dados devem provar a capacidade de detectar e quantificar, como apropriadas, alterações nos diferentes critérios específicos recomendados para observação, tais como sinais autonómicos, reactividade sensorial, força de preensão dos membros e actividade motora. Podem ser consultadas as referências 2 a 9 para informações sobre substâncias químicas que provocam diferentes respostas neurotóxicas e que podem ser utilizadas como controlos positivos. Podem ser utilizados dados históricos desde que os procedimentos experimentais não sejam alterados. Recomenda-se uma actualização periódica dos dados históricos. Caso o laboratório executante modifique alguns elementos essenciais da execução do ensaio ou procedimentos, devem obter-se novos dados comprovativos de que a sensibilidade dos procedimentos não foi alterada.

1.5.4 Selecção da dose

A escolha dos níveis de dose deverá tomar em consideração todos os dados de toxicidade e cinética existentes para a substância de ensaio ou as substâncias relacionadas. Deve ser seleccionado, o nível de dose mais elevado que induza efeitos neurotóxicos ou efeitos tóxicos sistémicos evidentes. Deve seleccionar-se uma sequência descendente de níveis de dose, que permita detectar qualquer resposta relacionada com a dose e determinar o nível sem efeito adverso observável (NSEAO) ao nível de dose mais baixo. Em princípio, os níveis de dose devem ser estabelecidos de modo a permitir distinguir entre os efeitos tóxicos primários no sistema nervoso e os efeitos relacionados com toxicidade sistémica. Em muitos casos, a melhor forma de estabelecer estas sequências consiste no espaçamento das doses em dois a três intervalos. A adição de um quarto grupo de ensaio é muitas vezes preferível ao uso de intervalos muito grandes entre as dosagens (ou seja, com um factor superior a 10). Nos casos em que existe uma estimativa razoável da exposição humana, esta deve também ser tomada em consideração.

1.5.5 Teste-limite

Se um ensaio com um nível de dose oral de pelo menos 1000 mg/kg de peso corporal/dia, realizado de acordo com os procedimentos descritos neste estudo, não provocar efeitos neurotóxicos observáveis e se, além disso, os dados existentes sobre compostos estruturalmente relacionados com a substância de ensaio não sugerirem a possível ocorrência de toxicidade, poderá considerar-se desnecessário realizar um ensaio completo com três níveis de dose. Nos casos em que se preveja exposição humana, poderá ser necessário aumentar o nível de dose oral no ensaio-limite. Quando se usam outras formas de administração, como inalação ou aplicação cutânea, as propriedades físico-químicas da substância de ensaio são muitas vezes indicativas e limitativas do nível máximo de exposição praticável. Para a execução do estudo oral agudo, a dose para o teste-limite deve ser, no mínimo, de 2000 mg/kg.

1.5.6 Administração de doses

A aplicação da dose da substância de ensaio, nos animais, é efectuada diariamente, sete dias por semana, durante um período de pelo menos 28 dias. O uso de um período de dosagem de cinco dias ou inferior deve ser justificado. A administração por sonda esofágica deve ser feita, de preferência, numa toma única, usando um tubo estomacal ou uma cânula de intubação apropriada. O volume máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. O volume não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal. Para soluções aquosas, contudo, pode ser considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Deve minimizar-se a variabilidade do volume de ensaio efectuando ajustes nas concentrações, de forma a assegurar a constância do volume em todos os níveis de dose; exceptuam-se os casos em que se utilizam substâncias irritantes ou corrosivas, que normalmente exercem efeitos exacerbados quando aplicadas em concentrações mais elevadas.

É importante assegurar que as quantidades da substância de ensaio administradas através da alimentação ou da água de beber não interferem nas exigências normais de nutrição ou de consumo de água. Quando a substância de ensaio for incorporada na alimentação, pode utilizar-se uma concentração alimentar constante (ppm) ou, alternativamente, um nível de dose constante em relação ao peso corporal dos animais; deve especificar-se o método escolhido para o ensaio. No caso de uma substância administrada por sonda esofágica, a dose deve ser administrada todos os dias à mesma hora, devendo ser ajustada pelo menos uma vez por semana a fim de se manter uma dose constante em relação ao peso corporal do animal. No caso de se efectuar um estudo de dose repetida, como estudo preliminar de um estudo de longo prazo, deve utilizar-se uma dieta semelhante em ambos os estudos. Nos estudos de toxicidade aguda, se não for possível a administração de uma toma única, a dose pode ser administrada em fracções menores ao longo de um período não superior a 24 horas.

1.6 OBSERVAÇÕES

1.6.1 Frequência das observações e ensaios

Nos estudos de dose repetida, o período de observação deve abranger o período de dosagem. Nos estudos de toxicidade aguda, deve ser observado um período de 14 dias após o tratamento. As observações devem também abranger este período para os animais em grupos-satélite que foram mantidos sem exposição durante o período após o tratamento.

As observações devem ser efectuadas com uma frequência suficiente para maximizar a probabilidade de detecção de qualquer anomalia comportamental e/ou neurológica. As observações devem ser, preferencialmente, efectuadas à mesma hora, todos os dias, tendo em conta o período de pico previsto de efeitos após aplicação da dose. Na Tabela 2, apresenta-se resumida a frequência das observações clínicas, bem como dos ensaios funcionais. No caso de existirem dados cinéticos ou outros dados obtidos em estudos prévios indicativos da necessidade de se utilizarem diferentes momentos de observação, ensaios ou períodos de observação posteriores, deve adoptar-se um calendário alternativo de modo a obter o máximo de informação. Deve apresentar-se uma justificação para as alterações introduzidas no calendário.

1.6.1.1 Observações do estado de saúde geral e da mortalidade/morbilidade

Todos os animais devem ser observados cuidadosamente, pelo menos uma vez por dia, para avaliar o seu estado de saúde geral, bem como, pelo menos duas vezes por dia, para avaliar a mortalidade e morbilidade.

1.6.1.2 Observações clínicas pormenorizadas

Devem ser efectuadas observações clínicas pormenorizadas em todos os animais seleccionados para este fim (consultar a Tabela 1) uma vez, antes da primeira exposição (de modo a permitir a comparação entre os diferentes animais) e, posteriormente, a diferentes intervalos, consoante a duração do estudo (consultar a Tabela 2). Devem ser também efectuadas observações clínicas pormenorizadas nos grupos-satélites de recuperação no final do período de recuperação. As observações clínicas pormenorizadas devem ser efectuadas no exterior do compartimento experimental, numa arena-padrão. Devem ser registadas cuidadosamente utilizando sistemas de pontuação que incluam escalas de critérios ou de pontuação para cada medição das observações. Os critérios ou escalas utilizados devem ser explicitamente definidos pelo laboratório de ensaio. Deve assegurar-se que as variações das condições de ensaio são mínimas (não sistematicamente relacionadas com o tratamento) e que as observações são efectuadas por pessoal especializado sem conhecimento do tratamento efectuado.

Recomenda-se que as observações sejam efectuadas de um modo estruturado, em que se aplicam sistematicamente critérios bem definidos (incluindo a definição de "gama" normal) a cada animal, em cada observação. A "gama normal" deve ser apropriadamente documentada . Devem ser registados todos os sinais observados. Sempre que possível, deve também ser registada a intensidade dos sinais observados. As observações clínicas devem incluir, entre outros aspectos, alterações na pele, pêlo, olhos, membranas mucosas, ocorrência de secreções e excreções e actividade autónoma (por exemplo, lacrimação, erecção pilosa, tamanho da pupila, padrão respiratório anormal e/ou respiração pela boca, quaisquer sinais pouco usuais de urina ou defecação e urina descorada).

Devem ser registadas quaisquer respostas pouco usuais relativas à posição corporal, nível de actividade (por exemplo, maior ou menor exploração da arena-padrão) e coordenação dos movimentos. Também devem ser registadas alterações na marcha (por exemplo, marcha bamboleante, ataxia), postura (por exemplo, dorso arqueado) e reactividade ao manuseamento, colocação ou outros estímulos ambientais, bem como a presença de movimentos clónicos ou tónicos, convulsões ou tremores, estereótipos (por exemplo, higiene excessiva, movimentos de cabeça pouco usuais, locomoção em círculos repetitiva) ou comportamento anómalo (por exemplo, morder ou lamber excessivamente, auto-mutilação, andar para trás, vocalização) ou agressão.

1.6.1.3 Ensaios funcionais

Tal como para o caso das observações clínicas pormenorizadas, devem ser efectuados ensaios funcionais uma vez antes da exposição e frequentemente após a exposição nos animais seleccionados para este fim (consultar a Tabela 1). A frequência dos ensaios funcionais depende também da duração do estudo (consultar a Tabela 2). Além dos períodos de observação, estabelecidos na Tabela 2, as observações funcionais dos grupos-satélite de recuperação devem também ser efectuadas o mais próximo possível da morte terminal. Os ensaios funcionais devem incluir, a reactividade sensorial a estímulos de várias tipos [por exemplo, estímulos auditivos, visuais e proprioceptivos (5)(6)(7)], a avaliação da força de preensão dos membros (8) e avaliação da actividade motora (9). A actividade motora, deve ser medida, com um dispositivo automático capaz de detectar tanto aumentos, como diminuições de actividade. Caso seja utilizado outro sistema definido, este deve ser quantitativo e a sua sensibilidade e fiabilidade devem ser comprovadas. Cada dispositivo deve ser ensaiado para assegurar a fiabilidade ao longo do tempo e a consistência entre os diferentes dispositivos. Nas respectivas referências apresenta-se informação detalhada sobre os procedimentos a seguir. Caso não existam quaisquer dados (por exemplo, relações estrutura-actividade, dados epidemiológicos, outros estudos toxicológicos) indicativos dos potenciais efeitos neurológicos, deve ser considerada a inclusão de ensaios mais especializados de função sensorial e motora ou de aprendizagem e memória de modo que estes possíveis efeitos sejam examinados mais pormenorizadamente.

Na referência (1) apresentam-se informações adicionais sobre os ensaios especializados e sua utilização. Excepcionalmente, os animais que apresentem sinais de toxicidade numa extensão que afecte significativamente o ensaio funcional, podem ser excluídos deste ensaio. Deve ser apresentada uma justificação para a exclusão de animais do ensaio funcional.

1.6.2 Peso corporal e consumo de alimento/água

Para estudos com duração até 90 dias, todos os animais devem ser pesados, pelo menos uma vez por semana, e devem ser feitas medições do consumo de alimentos (consumo de água, caso a substância de ensaio seja administrada por este meio) pelo menos semanalmente. Para estudos de longo prazo, todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por semana durante as 13 primeiras semanas e, seguidamente, pelo menos de 4 em 4 semanas. Devem ser feitas medições do consumo de alimentos (consumo de água, caso a substância de ensaio seja administrada por este meio), pelo menos semanalmente, nas primeiras 13 semanas e seguidamente, com um intervalo de cerca de três meses, excepto se o estado de saúde ou as variações de peso corporal indicarem que se deve fazer com outra periodicidade.

1.6.3 Oftalmologia

Para estudos de duração superior a 28 dias, deve ser efectuado um exame oftalmológico, utilizando um oftalmoscópio ou um instrumento equivalente adequado, antes da administração da substância de ensaio e no final do estudo. Preferencialmente este exame deve ser feito a todos os animais ou, pelo menos, aos animais dos grupos de doses elevadas e dos grupos de controlo. Todos os animais devem ser examinados caso sejam detectadas alterações oculares ou caso os sintomas clínicos assim o indiquem. Para estudos de longo prazo, o exame oftalmológico deve também ser efectuado no final de 13 semanas. Não é necessário efectuar os exames oftalmológicos se existirem dados disponíveis de outros estudos com duração semelhante e com níveis de dose semelhantes.

1.6.4 Hemograma e química clínica

Se o estudo de neurotoxicidade for efectuado em conjunto com um estudo de toxicidade sistémica de dose repetida, devem ser efectuadas análises clínicas (hemograma e química clínica), tal como estabelecido no respectivo Método do estudo de toxicidade sistémica. A recolha das amostras deve ser efectuada de modo a minimizar quaisquer potenciais efeitos no comportamento neuronal.

1.6.5 Histopatologia

O exame neuropatológico deve ser concebido a fim de complementar e aprofundar as observações efectuadas durante a fase in vivo do estudo. Os tecidos provenientes de, pelo menos, 5 animais de cada grupo do mesmo sexo (consultar a Tabela 1 e o parágrafo seguinte) devem ser fixados in situ por utilização de técnicas de perfusão e fixação comummente adoptadas (consultar a referência 3, capítulo 5 e a referência 4, capítulo 50). Devem ser registadas quaisquer alterações importantes que sejam observadas. No caso de o estudo ser efectuado independentemente para rastreio de neurotoxicidade ou para caracterizar efeitos neurotóxicos, os animais que não sejam utilizados podem sê-lo em procedimentos neurocomportamentais (10)(11), neuropatológicos (10)(11)(12)(13), neuroquímicos (10)(11)(14)(15) e electrofisiológicos específicos que podem complementar os procedimentos e exames descritos ou podem ser acrescentados aos animais sujeitos a exame histopatológico. Estes procedimentos complementares têm um interesse especial quando as observações empíricas ou os efeitos previstos são indicativos de um tipo ou alvo específicos para a neurotoxicidade (2)(3). Os animais não utilizados podem, alternativamente, sê-lo em avaliações patológicas de rotina tal como descritas no Método para estudos de dose repetida.

Deve ser utilizada uma técnica de coloração convencional, tal como hematoxilina ou eosina (H&E), em todas as amostras de tecidos, que devem ser fixadas em parafina e examinadas ao microscópio. Caso sejam observados sintomas de neuropatia periférica ou haja suspeitas nesse sentido, devem ser examinadas amostras de tecido nervoso periférico fixado em plástico. Os sintomas clínicos podem igualmente sugerir o exame a locais adicionais ou a utilização de técnicas de coloração especiais. Podem obter-se orientações sobre os locais adicionais a examinar em (3) e (4). Pode também ser útil a utilização de técnicas de coloração especiais apropriadas à demonstração de alterações patológicas específicas (18).

Os segmentos representativos dos sistemas nervosos central e periférico devem ser sujeitos a exame histopatológico (consultar a referência 3, capítulo 5 e a referência 4, capítulo 50). As áreas a examinar devem normalmente incluir: o cérebro anterior, o centro do cérebro, incluindo uma secção através do hipocampo, o mesencéfalo, o cerebelo, a ponte de Varolio, a medulla oblongata, o olho, incluindo o nervo óptico e a retina, a espinal medula ao nível das protuberâncias cervical e lombar, os gânglios da raiz dorsal, as fibras das raízes dorsal e ventral, o nervo ciático proximal, o nervo tibial proximal (no joelho) e as ramificações do nervo tibial nos gémeos. Devem ser examinadas as secções coronal, transversal e longitudinal da espinal medula e dos nervos periféricos. Deve ser dada especial atenção à vasculatura do sistema nervoso. Deve ser igualmente analisada uma amostra de músculo esquelético, nomeadamente, gémeos. Deve ser prestada especial atenção aos locais com estrutura e padrão celular e fibroso bi SNC e SNP que se saiba serem particularmente vulneráveis a substâncias neurotóxicas.

Podem obter-se orientações sobre as alterações neuropatológicas que resultam tipicamente da exposição a substâncias tóxicas nas referências (3) e (4). Recomenda-se um exame minucioso das amostras de tecidos, no qual são inicialmente comparados os cortes seccionais obtidos no grupo de dose mais elevada com os obtidos no grupo de controlo. Caso não sejam observadas quaisquer alterações neuropatológicas nas amostras provenientes desses grupos, não é necessário efectuar quaisquer análises subsequentes. Caso sejam observadas alterações neuropatológicas no grupo de dose mais elevada, as amostras de cada um dos tecidos potencialmente afectados provenientes dos grupos de doses intermédia e reduzida devem ser codificadas e analisadas sequencialmente.

Caso sejam detectados, no decorrer do exame qualitativo, quaisquer sintomas de alterações neuropatológicas, deve ser efectuado um segundo exame a todas as regiões do sistema nervoso que apresentem tais alterações. Cortes seccionais provenientes de todos os grupos de dosagem de cada uma das regiões potencialmente afectadas devem ser codificados e examinados ao acaso, sem conhecimento do respectivo código. Devem ser registadas a frequência e gravidade de cada lesão detectada. Após a classificação de todas as regiões em todos os grupos de dosagem, o código pode ser revelado e pode ser efectuada a análise estatística de modo a avaliar as relações dose-efeito. Devem descrever-se exemplos para os diferentes graus de gravidade das várias lesões.

Os dados neuropatológicas devem ser avaliados no contexto das observações comportamentais e das medidas efectuadas, assim como de quaisquer outros dados provenientes de estudos de toxicidade sistémica da substância de ensaio efectuados anterior ou simultaneamente.

2 DADOS

2.1 TRATAMENTO DOS RESULTADOS

Devem apresentar-se os dados individuais. Além disso, todos os dados devem ser resumidos em forma tabular, indicando, para cada grupo de ensaio ou de controlo, o número de animais no início do ensaio, o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou sacrificados a fim de evitar dor, o momento de todas as mortes (espontâneas ou provocadas), o número de animais apresentando sintomas de toxicidade, uma descrição dos sintomas de toxicidade observados (incluindo o momento do aparecimento, a duração, o tipo e a gravidade), o número de animais que apresentam lesões, incluindo o tipo e a gravidade de tais lesões.

2.2 AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Os resultados do estudo devem ser avaliados em termos da incidência, gravidade e correlação entre os efeitos observados aos níveis neurocomportamental e neuropatológico (assim como os efeitos neuroquímicos e electrofisiológicos, caso sejam efectuados quaisquer exames complementares) e quaisquer outros efeitos adversos observados. Sempre que possível, os resultados numéricos devem ser avaliados através de um método estatístico adequado e de utilização comum. Os métodos estatísticos devem ser determinados durante o planeamento do estudo.

3 RELATÓRIO

RELATÓRIO DO ENSAIO

O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:

Substância de ensaio:

Excipiente (se apropriado):

Animais de ensaio:

Condições do ensaio:

Observações e procedimentos de ensaio:

Resultados:

Análise dos resultados:

Conclusões:

4 REFERÊNCIAS

(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, (em preparação).

(2) Test Guidline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Em: Teratology

(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.

(4) Spencer, P.S. e Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Orgs. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams e Wilkins, Baltimore/ London.

(5) Tupper, D.E. e Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Protoplasma, 40, 999-1003.

(6) Stephan C.E. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.

(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. e Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.

(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. e Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore-and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.

(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. e MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.

(10) Tilson, H.A., e Mitchell, C.L. orgs. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.

(11) Chang, L.W., org. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.

(12) US EPA, (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.

(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. e MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352.

(14) Blaxter J.H.S. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.

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