Decreto-Lei n.º 79/2011 — Estabelece os procedimentos de elaboração de listas e de publicação de informações nos domínios veterinário e…

2 - Modo de execução:

Quando a agarose tiver endurecido, fazer as cavidades do seguinte modo:

3 - Adição de antigénio

ii) Cavidade B - antigénio de referência diluído a 1/2;

iii) Cavidades C e E - antigénio de referência;

iv) Cavidade D - antigénio a testar, não diluído.

ii) Cavidade B - antigénio a testar, diluído a 1/2

iii) Cavidade C - antigénio a testar, diluído a 1/4;

iv) Cavidade D - antigénio a testar, diluído a 1/8.

4 - Instruções complementares:

A diluição de trabalho é aquela em que se registar o mesmo diâmetro para o antigénio a testar e para o antigénio de referência.

Secção A — Controlo individual numa estação

1 - Deve indicar-se o nome do organismo ou da autoridade responsável pela estação, bem como o nome da autoridade responsável pelo cálculo e publicação dos resultados.

2 - Devem ser especificadas as normas que regem o teste.

3 - Devem explicitar-se os seguintes pontos:

Secção B — Controlo individual na exploração

Pode ser efectuado um controlo individual na exploração desde que no final do teste seja possível calcular, segundo os princípios zootécnicos estabelecidos, um valor genético.

Secção A — Controlo individual numa estação

1 - Devem indicar-se o nome do organismo ou da autoridade responsável pela estação, bem como o nome da autoridade responsável pelo cálculo e publicação dos resultados.

2 - Devem ser especificadas as normas que regem o teste.

3 - Devem ser explicitados:

Secção B — Controlo individual na exploração

Pode ser efectuado um controlo individual na exploração desde que, no final do teste, seja possível calcular um valor genético segundo os princípios zootécnicos estabelecidos.

Secção A — Ensaio ELISA competitiva para a detecção de anticorpos contra o vírus da peste equina (AHSV) (ensaio recomendado)

1 - O ensaio ELISA competitivo é utilizado para a detecção de anticorpos específicos de AHSV no soro de quaisquer espécies de equídeos. O imunossoro de cobaia anti-AHSV (adiante referenciado por «antissoro de cobaia»), de espectro largo e policlonal, é específico do serogrupo, sendo adequado à detecção de todos os serótipos do vírus AHS. O princípio do ensaio consiste na competição entre um antissoro de cobaia e a amostra do soro em análise para o antigénio AHSV. Os anticorpos anti-AHSV da amostra de soro em análise competem com os anticorpos do antissoro de cobaia, resultando numa redução da coloração esperada por adição de anticorpo anti-cobaia marcado com enzima e de substrato. Podem utilizar-se soros com uma diluição única de 1: 5 (método de ensaio pontual) ou, em alternativa, diluir-se sucessivamente a amostra para determinar o título final (método de titulação do soro). São considerados positivos os valores de inibição superiores a 50 %.

O protocolo a seguir descrito é utilizado pelo laboratório regional de referência para a peste equina, em Pirbright, no Reino Unido.

1.1 - Procedimento

1.1.1 - Preparação das placas

1.1.1.1 - Revestir placas ELISA com antigénio AHSV extraído de culturas de células infectadas diluído em tampão carbonato-bicarbonato a pH 9,6. Incubar as placas ELISA de um dia para o outro a 4 ºC.

1.1.1.2 - Lavar as placas três vezes, enchendo e esvaziando os alvéolos com tampão fosfato (PBS) a pH 7,2-7,4 e secar invertendo a placa sobre papel absorvente.

1.1.2 - Alvéolos-testemunha

1.1.2.1 - Distribuir ao longo da coluna 1 diluições sucessivas de 1: 2 a partir da diluição inicial, de 1: 5 até 1: 640, dos soros-testemunha positivos em tampão de bloqueio [PBS com 0,05 % (v/v) de Tween-20, 50 % (m/v) de leite em pó desnatado e 1 % (v/v) de soro de bovino adulto], de forma a obter um volume final de 50 (mi)l/alvéolo.

1.1.2.2 - Adicionar 50 (mi)l de soro-testemunha negativo diluído a 1: 5 (10 (mi)l de soro + 40 (mi)l de tampão de bloqueio) aos alvéolos A e B da coluna 2.

1.1.2.3 - Adicionar, por alvéolo, 100 (mi)l de tampão de bloqueio nos alvéolos C e D da coluna 2 (branco).

1.1.2.4 - Distribuir 50 (mi)l de tampão de bloqueio nos alvéolos E, F, G e H da coluna 2 (testemunha de cobaia).

1.1.3 - Método de ensaio pontual (diluição única da amostra)

1.1.3.1 - Distribuir em duas séries de alvéolos das colunas 3 a 12 diluições a 1: 5 de cada soro em tampão de bloqueio (10 (mi)l soro em análise + 40 (mi)l tampão de bloqueio); ou,

1.1.4 - Método de titulação do soro (diluição seriada)

1.1.4.1 - Distribuir, em oito alvéolos de cada uma das colunas 3 a 12, diluições sucessivas para metade (de 1: 5 a 1: 640) de cada amostra em tampão de bloqueio.

Seguidamente,

1.1.5 - Adicionar 50 (mi)l de anti-soro de cobaia, previamente diluído com tampão de bloqueio, a todos os alvéolos da placa ELISA, com excepção dos alvéolos correspondentes ao ensaio em branco (desta forma, todos os alvéolos devem conter um volume final de 100 (mi)l).

1.1.5.1 - Incubar a 37 ºC durante uma hora, utilizando um agitador orbital.

1.1.5.2 - Lavar as placas três vezes e secar do modo descrito anteriormente.

1.1.5.3 - Adicionar a cada alvéolo 50 (mi)l de anticorpo de coelho anti-cobaia conjugado com peroxidase de rábano (HRP), previamente diluído em tampão de bloqueio.

1.1.5.4 - Incubar a 37 ºC durante uma hora, utilizando um agitador orbital.

1.1.5.5 - Lavar as placas três vezes e secar do modo descrito anteriormente.

1.1.6 - Cromogénio

Preparar a solução de cromogénio (OPD = orto-fenildiamina) de acordo com as instruções dos fabricantes (0,4 mg/ml em água destilada estéril), imediatamente antes da utilização. Adicionar substrato (peróxido de hidrogénio = H 2 O 2) de forma a obter uma concentração final de 0,05 % (v/v) (1: 2000 numa solução de H 2 O 2 a 30 %), no caso de uma solução a 30 %. Adicionar 50 (mi)l de solução de OPD a cada alvéolo e deixar as placas durante 10 minutos à temperatura ambiente. Suspender a reacção por adição a cada alvéolo de 50 (mi)l de ácido sulfúrico (H2SO4) 1M.

1.1.7 - Determinações espectrofotométricas

Efectuar as determinações espectrofotométricas da densidade óptica (DO) a 492 nm.

1.2 - Expressão dos resultados

1.2.1 - Com recurso a um programa informático, obter os valores de DO e as percentagens de inibição (PI) correspondentes aos soros em análise e aos soros-testemunha, com base nos valores médios referentes aos quatro alvéolos com soro-testemunha de cobaia. Os valores de DO e PI são utilizados para determinar se os resultados dos ensaios se situam num intervalo aceitável. Os valores extremos (superior e inferior) de DO dos soros-testemunha de cobaia situam-se entre 1,4 e 0,4, respectivamente. Para uma PI de 50 %, o título final da testemunha positiva deve ser de 1: 240 (variação de 1: 120 a 1: 480). As placas que não sejam conformes aos referidos critérios devem ser rejeitadas. Todavia, se o título do soro-testemunha positivo exceder 1: 480 e as amostras em análise permanecerem negativas, são aceitáveis as amostras em análise negativas.

Ambos os alvéolos com soro-testemunha negativo e ambos os alvéolos correspondentes ao ensaio em branco devem apresentar valores de PI compreendidos entre + 25 % e -25 %, e entre + 95 e + 105 %, respectivamente. Se tal não suceder, não deve rejeitar-se a placa, havendo contudo que ter em conta a possibilidade de estar a desenvolver-se uma coloração de fundo.

1.2.2 - O limite positivo (cut-off) para os soros em análise é de 50 % (PI = 50 %). As amostras que apresentem valores de PI superiores a 50 % são consideradas positivas; as amostras que apresentem valores de PI inferiores a 50 % são consideradas negativas.

As amostras que apresentem, nos alvéolos repetidos, valores de PI superiores e inferiores ao limiar são consideradas duvidosas, podendo ser objecto de nova análise pelo método de ensaio pontual e por titulação. Podem também titular-se as amostras positivas, de forma a obter indicações quanto ao grau de positividade.

Representação esquemática do ensaio pontual

(ver documento original)

Representação esquemática do método de titulação sérica

(ver documento original)

Secção B — Ensaio ELISA indirecto para a detecção de anticorpos contra o vírus da peste equina (AHSV) (método recomendado)

1 - O ensaio seguidamente descrito é conforme à descrição apresentada no ponto 2.1.11 do Manual de normas para ensaios de diagnóstico e vacinas do OIE (quarta edição, 2000)

A proteína recombinante VP7 tem sido utilizada como antigénio para a determinação de anticorpos contra o virus AHS com um elevado grau de sensibilidade e especificidade. O facto de a proteína em causa ser estável e não ser infecciosa constitui outra vantagem.

1.1 - Procedimento

1.1.1 - Fase sólida

1.1.1.1 - Revestir as placas ELISA com proteína recombinante VP7 de AHSV-4 diluída em tampão de carbonato/bicarbonato a pH 9,6. Incubar as placas de um dia para o outro a 4ºC.

1.1.1.2 - Lavar as placas cinco vezes com água destilada contendo 0,01 % (v/v) de Tween 20 (solução de lavagem). Inverter e bater levemente com as placas num material absorvente, para a remoção de resíduos da solução de lavagem.

1.1.1.3 - Bloquear as placas mediante a adição a cada alvéolo de 200 (mi)l de PBS com 5 % (m/v) de leite desnatado (leite em pó desnatado, incubando a 37 ºC durante uma hora.

1.1.1.4 - Remover a solução de bloqueio; inverter e bater levemente com as placas num material absorvente.

1.1.2 - Amostras em análise

1.1.2.1 - Diluir as amostras de soro em análise, bem como os soros das testemunhas positiva e negativa, na proporção 1: 25, em PBS + 5 % (m/v) leite desnatado + 0,05 % (v/v) Tween 20, adicionando 100 (mi)l a cada alvéolo. Incubar a 37 ºC durante uma hora.

Preparar nos alvéolos de cada coluna (100 (mi)l/alvéolo) diluições sucessivas para metade de cada soro (diluição inicial 1: 25), procedendo da mesma forma com as testemunhas positiva e negativa. Incubar a 37.ºC durante uma hora.

1.1.2.2 - Lavar as placas do modo descrito em 1.1.1.2.

1.1.3 - Conjugado

1.1.3.1 - Distribuir por cada alvéolo 100 (mi)l de anti-gama globulina de cavalo conjugada com peroxidase de rábano (HRP) diluída em PBS + 5 % de leite + 0,05 % Tween 20 a pH 7,2. Incubar a 37 ºC durante uma hora.

1.1.3.2 - Lavar as placas do modo descrito em 1.1.1.2.

1.1.4 - Cromogénio/Substrato

1.1.4.1 - Distribuir por cada alvéolo 200 (mi)l de solução cromogénio/-substrato [10 ml DMAB (dimetilaminobenzaldeído) + 10 ml MBTH (cloridrato de 3-metil-2-benzotiazolino-hidrazona) + 5 (mi)l H2O2).

O desenvolvimento da coloração é suspenso pela adição de 50 (mi)l de H 2 SO4 3N decorridos 5-10 minutos (antes do início da coloração da testemunha negativa).

Podem utilizar-se outros cromogénios, tais como ABTS (ácido 2,2'-azino-bis[3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico]), TMB (tetrametil-benzidina) ou OPD (orto-fenildiamina).

2.1.4.2 - Efectuar as leituras espectrofotométricas da densidade óptica (DO) a 600 nm (ou 620 nm).

1.2 - Interpretação dos resultados

1.2.1 - Calcular o valor-limite (cut-off) adicionando 0,6 ao valor obtido para a testemunha negativa (0,6 é o desvio-padrão obtido com um grupo de 30 soros negativos).

1.2.2 - As amostras que apresentarem valores de absorvância inferiores ao valor-limite são consideradas negativas.

1.2.3 - As amostras que apresentarem valores de absorvância superiores ao valor-limite acrescido de 0,15 são consideradas positivas.

1.2.4 - As amostras que apresentem valores de absorvância intermédios são duvidosas, devendo utilizar-se outra técnica para confirmar o resultado.

Secção A — Estabelecimentos de selecção, de multiplicação e de criação

1 - Instalações:

2 - Condução da criação de aves de capoeira:

ii) De outros estabelecimentos de criação, de selecção ou de multiplicação comunitários, igualmente aprovados em conformidade com a alínea a) do n.º 1 do artigo 7.º;

iii) De importações em conformidade com o presente regulamento.

ii) Os níveis de produção;

iii) A morbilidade, a mortalidade e as respectivas causas;

iv) Os exames laboratoriais efectuados e os resultados obtidos;

vi) O destino dos ovos.

Secção B — Centros de incubação

1 - Instalações:

ii) Desinfecção;

iii) Pré-incubação;

iv) Eclosão;

2 - Funcionamento:

ii) De importações a partir de países terceiros efectuadas em conformidade com o presente regulamento;

ii) As incubadoras, regularmente;

iii) Os locais de eclosão e ao material, após cada eclosão;

ii) Os resultados da eclosão;

iii) As anomalias verificadas;

iv) Os exames laboratoriais efectuados e os resultados obtidos;

vi) O número e o destino dos ovos incubados que não eclodiram;

vii) O destino dos pintos do dia;

Secção A — Infecções por Salmonella pullorum-gallinarum e Salmonella Arizonae

1 - Espécies afectadas:

2 - Programa de controlo sanitário:

S. Pullorum ou de S. Arizonae, tem em conta, para o número de amostras a recolher, a prevalência da infecção no país e os seus antecedentes no estabelecimento, devendo os bandos ser controlados em cada período de postura, na altura mais propícia à detecção da doença.

Secção B — Infecções de Mycoplasma Gallisepticum e Mycoplasma Meleagridis

1 - Espécies afectadas:

2 - Programa de controlo sanitário:

3 - Resultados e medidas a tomar:

Não havendo reacções, o controlo é negativo. No caso de resultados positivos, há suspeita de infecção, devendo ser aplicadas ao bando as medidas previstas no capítulo IV.

4 - No caso de explorações, que abranjam várias unidades de produção diferentes, a DGV pode derrogar essas medidas, em relação às unidades de produção sãs dentro de uma exploração contaminada, desde que o veterinário habilitado confirme que a estrutura e as dimensões dessas unidades de produção, bem como as operações nelas efectuadas são de molde a garantir que, a nível do alojamento, da manutenção e da alimentação, essas unidades de produção são completamente independentes entre si, e que a doença em questão não possa propagar-se de uma unidade de produção para outra.

Secção A — Condições de aprovação

Os centros de colheita de sémen devem:

ii) Instalações de isolamento que não comuniquem directamente com as instalações normais de alojamento dos animais;

iii) Instalações de colheita de sémen que incluam uma sala separada para a limpeza e desinfecção ou esterilização do equipamento;

iv) Uma sala de tratamento do sémen separada das instalações de colheita, que não tem necessariamente que ser no mesmo local;

Secção B — Condições de fiscalização

Os centros de colheita de sémen devem:

ii) Todas as deslocações de animais que entrem e saiam do centro;

iii) A história sanitária e todos os testes de diagnóstico e seus resultados, tratamentos e vacinas efectuados nos animais que aí permaneçam;

iv) A data da colheita e tratamento do sémen;

vi) A armazenagem do sémen.

ii) A colheita, tratamento e armazenagem do sémen sejam efectuados apenas nas instalações destinadas a esses fins;

iii) Todos os utensílios que entrem em contacto com o sémen ou com o animal dador durante a colheita ou tratamento sejam adequadamente desinfectados ou esterilizados antes da utilização ou que sejam novos, descartáveis e eliminados após a utilização e se, no caso dos equídeos, o centro de colheita de sémen partilhar qualquer local com o centro de inseminação artificial ou de beneficiação, deve existir uma separação rigorosa entre os instrumentos e equipamento destinados à inseminação artificial ou à beneficiação e os instrumentos e equipamento que contactem com animais dadores ou outros animais mantidos no centro de colheita e o sémen;

iv) Os produtos de origem animal, como, por exemplo, diluentes ou aditivos, utilizados no tratamento do sémen não ponham em risco a saúde dos animais ou tenham sido previamente tratados de forma a evitar esse risco;

vi) Todos os recipientes de armazenagem ou transporte do sémen sejam desinfectados ou esterilizados, conforme adequado, antes da utilização, ou sejam novos, descartáveis e eliminados após a utilização.

Secção A — Garanhões

Só podem ser utilizados para a colheita de sémen os garanhões que, a contento do veterinário do centro, satisfaçam as condições a seguir indicadas:

ii) Um teste de seroneutralização para a artrite viral dos equídeos, com resultados negativos a uma diluição serológica de 1/4 ou, caso contrário, um teste de isolamento do vírus para a artrite viral dos equídeos efectuado com resultados negativos numa alíquota de todo o sémen do garanhão dador;

iii) Um teste para a metrite contagiosa dos equídeos efectuado em duas ocasiões com um intervalo de sete dias através do isolamento de Taylorella equigenitalis em fluido pré-ejaculatório ou numa amostra de sémen e em esfregaços genitais colhidos, pelo menos, da fossa uretral, incluindo o seio uretral, e do pénis, incluindo a fossa glandis, com resultados negativos em ambos os casos.

E o garanhão dador residir continuamente no centro de colheita nos 30 dias que precedem a primeira colheita de sémen e durante o período de colheita, e se nenhum equídeo do centro de colheita contactar directamente com equídeos de estatuto sanitário inferior ao do garanhão dador, os testes previstos nas subalíneas i), ii), e iii) da alínea anterior são efectuados, pelo menos, 14 dias após o início desse período de residência e pelo menos uma vez por ano no início da época de reprodução;

O garanhão dador não residir continuamente no centro de colheita e ou outros equídeos do centro de colheita contactarem directamente com equídeos de estatuto sanitário inferior, os testes indicados nas subalíneas i), ii) e iii) da alínea anterior são efectuados no prazo de 14 dias anterior à primeira colheita de sémen e pelo menos uma vez por ano no início da época de reprodução. Além disso, o teste exigido na subalínea i) da alínea anterior é repetido com um intervalo não superior a 120 dias durante o período de colheita de sémen. O teste exigido na subalínea ii) da alínea anterior é efectuado até um máximo de 30 dias antes de cada colheita de sémen, excepto se a fase não contagiosa de um garanhão seropositivo relativamente à artrite viral dos equídeos for confirmada por um teste de isolamento do vírus efectuado anualmente.

ii) Se o sémen for colhido para comércio no estado congelado, são aplicáveis os programas de testes descritos na subalínea i) da alínea e) ou, em alternativa, são efectuados os testes exigidos nas subalíneas i), ii) e iii) da alínea anterior durante o período obrigatório de armazenagem do sémen, de 30 dias, e não antes de 14 dias após a colheita do sémen, independentemente do estatuto de residência do garanhão.

Secção B — Ovinos e caprinos

1 - Só podem ser afectos à colheita de sémen os ovinos e caprinos dos centros, estações ou explorações que, a contento do veterinário oficial:

ii) Um teste de pesquisa da epididimite contagiosa do carneiro (Brucella ovis) de acordo com o anexo D do Decreto-Lei n.º 227/2004, de 7 de Dezembro;

iii) Um teste de isolamento do vírus da border disease;

2 - Os exames referidos no número anterior devem ser efectuados por um laboratório aprovado.

Secção A — Detecção do vírus da doença de Newcastle

No diagnóstico de infecções em aves vacinadas têm sido utilizados diversos testes rápidos que detectam directamente os antigénios da doença de Newcastle. Os testes geralmente mais utilizados até ao momento são os testes de anticorpos com fluorescência em secções longitudinais da traqueia e os testes de anticorpos com peroxidase no cérebro. Não há motivos para crer que não possam ser aplicados outros testes de detecção directa do antigénio no caso das infecções provocadas pelo vírus da doença de Newcastle.

O inconveniente destes testes é que não é possível examinar todos os locais potenciais de replicação do vírus da doença de Newcastle nas aves vacinadas. Assim, por exemplo, a ausência de indícios do vírus na traqueia não exclui a replicação do vírus no intestino. Não é recomendado nenhum método directo de detecção para uso de rotina no diagnóstico da doença de Newcastle, apesar de estes testes poderem ter uma função útil em circunstâncias específicas.

Secção B — Detecção de anticorpos em aves não vacinadas

A maioria dos laboratórios ligados ao diagnóstico da doença de Newcastle estão familiarizados com o teste de inibição da hemaglutinação e a recomendação feita mais adiante aplica-se a este teste para a medição dos anticorpos do vírus. No entanto, o teste de imunoabsorção enzimática (Elisa) pode ser utilizado com êxito na detecção de anticorpos do vírus. Sugere-se que, caso se pretenda utilizar o teste Elisa ao nível de um laboratório regional, o teste seja controlado pelo laboratório nacional referido no anexo B ao presente regulamento, do qual faz parte integrante.

Parte A

Amostras

Devem ser colhidas amostras de sangue de todas as aves se a dimensão do bando for inferior a 20, ou de 20 aves no caso de bandos maiores (tal dá origem a uma probabilidade superior a 99 % de detectar pelo menos um soro positivo se 25 % ou mais do bando for positivo, independentemente da dimensão do bando). Deve deixar-se o sangue coagular, utilizando-se o soro na realização do teste.

Parte B

Pesquisa de anticorpos

As amostras individuais de soro devem ser submetidas a testes-padrão de inibição da hemaglutinação, como descritas no capítulo VI, a fim de determinar a sua capacidade para inibirem o antigénio hemaglutinante do vírus da doença de Newcastle.

Existe alguma polémica sobre se devem ser utilizados quatro ou oito unidades de hemoglutinina nos testes de inibição da hemaglutinação. Aparentemente, ambas as doses são válidas e deveria caber aos laboratórios nacionais a escolha da dose a utilizar. Todavia, o antigénio utilizado afecta o nível em que um soro é considerado positivo; para quatro unidades de hemaglutinina, considera-se positivo o soro que apresenta um título igual ou superior a 2 4; para oito unidades de hemaglutinina, considera-se positivo o soro que apresenta um título igual ou superior a 2 3.

Secção A — Reagentes

1 - Solução isotónica salina tamponada com fosfato (0,05M) com um pH de 7,0 a 7,4;

2 - Colher hemácias de, pelo menos, três frangos sem organismos patogénicos específicos (se tal não for possível, pode colher-se sangue de aves controladas regularmente e que se tenham apresentado isentas de anticorpos do vírus da doença de Newcastle) e misturá-las num volume igual de solução de Alsever. As células devem ser lavadas três vezes na solução isotónica salina tamponada com fosfato antes da sua utilização. Para o teste, recomenda-se uma suspensão a 1 % (células empacotadas v/v).

3 - É recomendada a utilização da estirpe Ulster de 2C do vírus da doença de Newcastle como antigenio-padrão.

Secção B — Método

1 - Colocar 0,025 ml de solução isotónica salina tamponada com fosfato em cada cavidade de uma placa de microtitulação de plástico (devem ser utilizadas cavidades com fundos em «V»).

2 - Colocar 0,025 ml de suspensão de vírus (isto é, líquido alantóico) na primeira cavidade.

3 - Utilizar um diluente de microtitulação para proceder às diluições duplas (1:2 a 1:4096) do vírus de cavidade ao longo da placa.

4 - Colocar mais 0,025 ml de solução isotónica salina tamponada com fosfato em cada cavidade.

5 - Juntar 0,025 ml de hemácias a 1 % em cada cavidade.

6 - Misturar agitando ligeiramente e colocar a 4ºC.

7 - Ler as placas 30 a 40 minutos depois, quando as testemunhas tiverem sedimentado. A leitura é feita inclinando a placa para observar a presença ou a ausência de um fluxo, em forma de lágrima, das hemácias. As cavidades sem hemaglutinação devem fluir à mesma velocidade que as células testemunha sem vírus.

8 - O título de hemaglutinação é a diluição mais elevada que provoca a aglutinação das hemácias. Essa diluição pode ser considerada como contendo uma unidade de hemaglutinação. Um método mais exacto de determinação do título de hemaglutinação consiste na realização de testes de hemaglutinação em vírus provenientes de uma série de diluições iniciais mais próximas, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 etc. Este método é recomendado para a preparação exacta do antigénio destinado aos testes de inibição da hemaglutinação (capítulo VI).

Secção A — Reagentes

(V. capítulo V)

1 - Solução isotónica salina tamponada com fosfato.

2 - Líquido alantóico com vírus, diluído numa solução isotónica salina tamponada com fosfato de modo a conter quatro ou oito unidades de hemaglutinação por 0,025 ml.

3 - Hemácias de frango a 1 %.

4 - Soro-testemunha de frango negativo.

5 - Soro-testemunha positivo.

Secção B — Método

1 - Colocar 0,025 ml de solução isotónica salina tamponada com fosfato em todas as cavidades de uma placa de microtitulação de plástico (com cavidades com fundos em «V»).

2 - Colocar 0,025 ml de soro na primeira cavidade da placa.

3 - Utilizar um diluente de microtitulação para fazer diluições duplas de soro de cavidade em cavidade ao longo da placa.

4 - Adicionar 0,025 ml de líquido alantóico diluído contendo quatro ou oito unidades de hemaglutinação.

5 - Misturar agitando ligeiramente e colocar a placa a 4ºC durante, pelo menos, 60 minutos ou à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos.

6 - Adicionar 0,025 ml de hemácias a 1 % em todas as cavidades.

7 - Misturar agitando ligeiramente e colocar a 4ºC.

8 - Ler as placas 30 a 40 minutos depois, quando as hemácias-testemunha tiverem sedimentado. A leitura é feita inclinando a placa para observar a presença ou a ausência de um fluxo, em forma de lágrima, das hemácias. As cavidades sem hemaglutinação devem fluir à mesma velocidade que as células testemunha que contêm apenas hemácias (0,025 ml) e solução isotónica salina tamponada com fosfato (0,05 ml).

9 - O título da inibição da hemaglutinação é a diluição mais elevada de anti-soro que provoca a inibição completa de quatro ou oito unidades de vírus (deveria ser incluída em cada teste uma titulação da hemaglutinação para confirmar a presença do número de unidades de hemaglutinação necessário).

10 - A validade dos resultados depende da obtenção de um título inferior a 2 3 para quatro unidades de hemaglutinação ou 2 2 para oito unidades de hemaglutinação com o soro-testemunha negativo e de um título com a diferença de apenas uma diluição em relação ao título conhecido do soro-testemunha positivo.